本发明涉及抗体领域，具体地，涉及一种结合c5ar2膜蛋白的抗体及其制备方法。
背景技术：
1、c5ar2(又称为c5l2或gpr77，uniprot:q9p296)为g蛋白偶联受体(gpcr)超家族中补体受体亚家族的一员。c5ar1和c5ar2为c5ar补体受体的两种亚型，二者在中性粒细胞，巨噬细胞，星形胶质细胞等多种细胞上共表达，均为炎症介质补体c5a的受体蛋白。c5ar1和c5ar2与c5a的亲和力相当，c5ar2与c5a-des-arg结合亲和力比c5ar1更高。c5ar1是典型的gpcr，通过g蛋白偶联活化介导下游信号通路，或者介导非g蛋白依赖的β-arrestin信号传导。而c5ar2是非典型的gpcr，并不表现g蛋白偶联活性，只通过β-arrestins信号传导。c5ar2的第3和第7跨膜区不含保守的dry及npxxy基序，代之以d131lc和n287plmf，其胞内第3结构域为截短形式，这些结构特征很可能对其功能产生重要影响。c5ar2是治疗炎症相关疾病药物开发的热点，另有研究表明在肿瘤治疗领域，靶向c5ar2的阻断抗体能够减少肿瘤干细胞的数目和增强肿瘤化疗敏感性[1,2]。
2、由于gpcr膜蛋白表达量低，难以制备获得用于免疫及抗体筛选的c5ar2抗原蛋白。vlp展示全长膜蛋白或vlp展示特定膜蛋白表位，成为优良的免疫抗原。包膜vlp展示全长膜蛋白，膜蛋白具有天然构象，vlp具有免疫佐剂的作用，能够激发宿主产生针对膜蛋白的免疫反应，有利于筛选获得膜蛋白特异性抗体。非包膜vlp展示膜蛋白重要表位，有利于激活宿主产生针对特定表位的免疫反应，从而筛选获得功能抗体。开发结合c5ar2膜蛋白的抗体能够成为研究gpcr的工具，也具有药物开发的潜力。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供结合c5ar2膜蛋白的抗体及其制备方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种抗c5ar2抗体或其抗原结合片段，所述抗c5ar2抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
3、(z1)所述重链可变区包含以下3个cdr：seq id no:7所示的h-cdr1；seq id no:8所示的h-cdr2；seq id no:9所示的h-cdr3；以及
4、所述轻链可变区包含以下3个cdr：seq id no:13所示的l-cdr1；序列如gis所示的l-cdr2；seq id no:14所示的l-cdr3；或
5、(z2)所述重链可变区包含以下3个cdr：seq id no:17所示的h-cdr1；seq id no:18所示的h-cdr2；seq id no:19所示的h-cdr3；以及
6、所述轻链可变区包含以下3个cdr：seq id no:23所示的l-cdr1；序列如lvs所示的l-cdr2；seq id no:24所示的l-cdr3。
7、在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区还包含fr区。
8、在另一优选例中，所述重链可变区包含鼠源或人源的fr区，和/或所述轻链可变区包含鼠源或人源的fr区。
9、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
10、所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如seq id no:12所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
11、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no:6所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no:12所示的轻链可变区。
12、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如seq id no:16所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
13、所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如seq id no:22所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
14、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no:16所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no:22所示的轻链可变区。
15、在另一优选例中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
16、在另一优选例中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的或人源的。
17、在另一优选例中，所述重链恒定区来源于小鼠重链igg1或igg2a。
18、在另一优选例中，所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。
19、在另一优选例中，所述重链恒定区包含如seq id no:10或20所示的氨基酸序列。
20、在另一优选例中，所述轻链恒定区包含如seq id no:15所示的氨基酸序列。
21、在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双链抗体、单链抗体(scfv)、fab、fab'、f(ab')2抗体。
22、在另一优选例中，所述抗体为重组抗体。
23、在另一优选例中，所述抗体为重组单克隆抗体，其包含氨基酸序列如seq id no:1所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:2所示的轻链。
24、在另一优选例中，所述重组单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no:3所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:4所示的轻链。
25、在另一优选例中，所述抗体包括动物源抗体(例如不同亚型的鼠源抗体)、嵌合抗体(例如人-鼠嵌合抗体)、人源化抗体。
26、在另一优选例中，所述抗体结合人c5ar2和食蟹猴c5ar2，具有人/猴交叉种属结合活性。
27、在另一优选例中，所述抗体与c5a配体竞争性结合c5ar2，阻断c5a配体与c5ar2结合。
28、在本发明的第二方面，提供了一种重组抗体，所述的重组抗体具有：
29、(i)如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段的序列；以及
30、(ii)促进抗体分泌表达的信号肽和/或用于纯化、检测的标签序列。
31、在另一优选例中，所述重组抗体具有促进抗体分泌表达的信号肽。
32、在另一优选例中，所述信号肽具有如seq id no:5、11或21所示的氨基酸序列。
33、在另一优选例中，所述的标签序列选自：flag、myc、his标签等。
34、在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq id no:1所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:2所示的轻链。
35、在另一优选例中，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq id no:3所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:4所示的轻链。
36、在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸分子，其编码选自下组的多肽：
37、(1)如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段；或
38、(2)如本发明第二方面所述的重组抗体。
39、在另一优选例中，所述多核苷酸分子包含如seq id no:25-28中任一项所示的核苷酸序列。
40、在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，其含有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
41、在另一优选例中，所述载体包括真核细胞表达载体、原核细胞表达载体。
42、在另一优选例中，所述载体为哺乳细胞表达载体。
43、在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
44、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有如本发明第四方面所述的载体，或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸分子。
45、在另一优选例中，所述宿主细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)、原核细胞。
46、在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含：
47、(a)如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段或如本发明第二方面所述的重组抗体；和
48、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、酶、细胞因子、放射性核素、纳米颗粒/纳米棒。
49、在另一优选例中，所述可检测标记物包括荧光标记物或化学发光标记物。
50、在另一优选例中，所述放射性核素包括：诊断用同位素；和/或治疗用同位素。
51、在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物。
52、在另一优选例中，所述细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、dna小沟结合试剂、dna复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
53、在另一优选例中，所述抗体偶联物为抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)。
54、在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
55、(a)如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物；以及
56、(b)药学上可接受的载体。
57、在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。
58、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗与c5ar2相关的疾病或病症的药物。
59、在另一优选例中，所述与c5ar2相关的疾病或病症包括炎症疾病、癌症或肿瘤。
60、在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物的用途，用于制备：
61、(1)用于检测c5ar2分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒；
62、(2)用于预防和/或治疗与c5ar2相关的疾病或病症的药物。
63、在另一优选例中，所述与c5ar2相关的疾病或病症包括炎症疾病、癌症或肿瘤。
64、在另一优选例中，所述检测包括流式检测(facs)、细胞免疫荧光检测、elisa检测、蛋白质免疫印记(wb)检测。
65、在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。
66、在本发明的第九方面，提供了一种产生如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的重组抗体的方法，包括步骤：
67、(s 1)在适合产生抗体或抗原结合片段的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗体或抗原结合片段的培养物；
68、(s2)从所述培养物中分离或回收所述抗体或抗原结合片段；以及
69、(s3)任选地，纯化和/或修饰得步骤(b)中获得的抗体或抗原结合片段。
70、在本发明的第十方面，提供了一种检测样品中c5ar2蛋白的方法，所述方法包括步骤：
71、(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物接触；
72、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在c5ar2蛋白。
73、在另一优选例中，所述样品包括：离体组织样品、细胞样品。
74、在另一优选例中，所述方面为体外方法。
75、在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。
76、在本发明的第十一方面，提供了一种筛选抗c5ar2抗体的方法，包括步骤：
77、(s1)使用vlp多价展示c5ar2蛋白或c5ar2蛋白表位，用哺乳动物细胞表达，从而获得用于免疫的c5ar2抗原-vlp；
78、(s2)使用步骤(s1)中制备的c5ar2抗原-vlp免疫受试动物，收集经免疫后动物的抗血清；
79、(s3)检测收集的抗血清与所述c5ar2抗原-vlp的结合，若结合为阳性，则取经免疫后动物的脾脏，制备杂交瘤克隆；
80、(s4)用所述c5ar2抗原-vlp对杂交瘤克隆进行初筛，从而获得抗原结合阳性的杂交瘤克隆；
81、(s5)使用不含c5ar2抗原的空vlp进一步对抗原结合阳性的克隆进行负筛选，筛选出只结合c5ar2抗原的阳性杂交瘤克隆；
82、(s6)将只结合c5ar2抗原的阳性杂交瘤克隆有限稀释至单克隆状态，重复验证单克隆杂交瘤细胞上清与c5ar2抗原的结合，从而获得能够产生特异性结合c5ar2抗原的抗c5ar2抗体的单克隆杂交瘤细胞株。
83、在另一优选例中，所述c5ar2抗原-vlp是展示全长人c5ar2的包膜vlp(humanc5ar2/vlp)，或展示人c5ar2的n端序列的非包膜vlp(human c5ar2ntd-vlp)。
84、在另一优选例中，所述人c5ar2的n端序列具有如seq id no:29所示的氨基酸序列。
85、在另一优选例中，所述哺乳动物细胞选自：hek293细胞、cho细胞。
86、在另一优选例中，所述受试动物选自：小鼠、大鼠、家兔、山羊、猴等。
87、在另一优选例中，所述步骤(s3)中的检测为elisa检测。
88、在另一优选例中，所述步骤(s4)和(s5)中的筛选均采用间接elisa法。
89、在本发明的第十二方面，提供了一种预防和/或治疗与c5ar2相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：给有需要的受试者施用如本发明第一方面所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的重组抗体、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物。
90、在另一优选例中，所述有需要的受试者包括人类或非人类哺乳动物。
91、在另一优选例中，所述与c5ar2相关的疾病或病症包括炎症疾病、癌症或肿瘤。
92、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种抗c5ar2抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗c5ar2抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如seq id no:6所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如seq id no:16所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
4.一种重组抗体，其特征在于，所述的重组抗体具有：
5.如权利要求4所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq idno:1所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:2所示的轻链。
6.如权利要求4所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含氨基酸序列如seq idno:3所示的重链，以及氨基酸序列如seq id no:4所示的轻链。
7.一种多核苷酸分子，其编码选自下组的多肽：
8.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包含：
9.如权利要求1所述的抗c5ar2抗体或其抗原结合片段、如权利要求4所述的重组抗体、或如权利要求8所述的抗体偶联物的用途，用于制备：
10.一种筛选抗c5ar2抗体的方法，包括步骤：
