本发明属于医药化工，具体涉及点击型共价药物，肿瘤胞外、内酸响应两亲性聚合物及区域选择性递送系统、制备方法及其应用。
背景技术：
1、癌症免疫治疗药物是激活病人自身免疫系统攻击肿瘤细胞，从而消除肿瘤。通过干预肿瘤免疫环中不同的阶段，多种治疗策略被用于临床治疗癌症病人，如治疗性疫苗，细胞疗法以及免疫检查点疗法。然而，肿瘤一方面通过降低免疫原性、上调免疫负调节因子(如pd-l1、ido等)逃避机体免疫系统的识别，另一方面通过肿瘤相关成纤维细胞、相关巨噬细胞和胶原蛋白等组成致密的胞外基质形成“物理屏障”，限制肿瘤特异性t细胞的浸润，二者协同导致肿瘤免疫耐受，临床单一治疗响应率低。此外，现有肿瘤免疫治疗策略难以实现对肿瘤细胞内、外区域选择性调控，是导致临床治疗响应率较低的另一个重要原因。因此，针对区域选择调控肿瘤胞内、外靶点这一临床关键挑战，同时克服其“生物”、“物理”屏障，促进肿瘤特异性t细胞浸润，提高响应率的治疗策略，具有重要临床意义。目前，非小分子抗肿瘤药物存在水溶性差、药动力学性质较差、亲和力较低和缺乏靶向性。小分子共价抑制剂相比于非共价抑制剂具有提高生物化学效率和效力，延长作用持续时间，延长药物药代动力学，降低剂量和给药频率等优势。与传统的非共价抑制剂相比，非共价抑制剂依靠疏水作用、氢键与静电相互作用与靶蛋白可逆地结合，这些作用力强度弱于共价化学键，因此共价抑制剂的药效强度往往强于非共价抑制剂。然而，相比于更容易开发的激酶小分子共价抑制剂，直接靶向肿瘤细胞的小分子共价抑制剂至今仍未被报道。小分子共价抑制剂靶向天然氨基酸残基(半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸以及精氨酸和谷氨酸)的传统共价策略可能会引起强烈的毒副作用。此外，氨基酸在蛋白质，细胞和体内的普遍存在给实现对蛋白质靶标的反应选择性带来了巨大的挑战。因此，开发共价小分子药物的关键在于在反应性和选择性之间取得适当的平衡。为了能够产生用于体内靶向肿瘤的小分子共价药物，需要一种新的策略来设计小分子共价抑制剂的化学反应性，该化学反应性是生物相容的，并且对靶标具有高度特异性。
技术实现思路
1、基于以上背景，本发明的目的是利用点击化学和肿瘤胞内、外酸激活两亲性嵌段聚合物设计开发了区域选择性递送系统，该递送系统由可点击型共价药物和肿瘤胞内、外酸响应两亲性嵌段聚合物共组装形成纳米粒；该纳米粒在肿瘤胞外、内酸环境中次序激活释放负载的可点击型共价药物以及其他联合治疗药物。首先，在肿瘤胞外微酸环境下释放出可点击药物，与预先叠氮标记的肿瘤细胞发生共价结合，从而实现在体内特异性抑制肿瘤胞外靶点；待纳米粒被细胞摄取后，胞内酸激活药物释放，调控胞内靶点；二者协同对肿瘤实现区域选择性调控。
2、实现本发明目的的具体技术方案是：
3、一类点击型共价药物，所述点击型共价药物能够与叠氮标记的靶蛋白发生点击反应形成共价键，其具有以下式1所示结构：
4、
5、其中，
6、r1为膜蛋白抑制剂、免疫调节剂或化疗药物，具有如下结构：
7、
8、linker为r1与羰基之间的连接链，选自以下结构中的任意一种，
9、
10、其中，n为1-20任意整数，优选地为2-10的整数。
11、一种所述点击型共价药物的制备方法，该方法具体包含如下步骤，通过以下反应路线i所示的酯化反应合成所述的点击型共价药物：
12、
13、
14、其中，linker，r1如权利要求1所述；
15、步骤a：氮杂环形炔linker衍生物即dbco-linker的合成
16、将羧基氮杂环形炔、linker、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及n，n-二异丙基乙胺以摩尔比为1∶2∶2∶2∶2的比例溶于二氯甲烷中，得到质量浓度为20-40％w/v的溶液；在无水条件下，室温反应24h，反应产物用薄层色谱法纯化，得到氮杂环形炔linker衍生物即dbco-linker；
17、
18、步骤b：点击型共价药物的合成
19、将r1、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及n，n-二异丙基乙胺以摩尔比为1∶2∶2∶2或将r1、三乙胺及三光气以摩尔比为1∶1.5∶0.3溶于无水二氯甲烷或二甲基亚砜中制得40％w/v溶液b，反应1.5h；取所述步骤a中得到的氮杂环形炔linker衍生物溶于无水二氯甲烷中，得到质量浓度为20-40％w/v的溶液a；将溶液a滴加到溶液b中，继续反应24h，然后用薄层色谱法纯化，得到点击型共价药物，式1所示的化合物；
20、
21、其中，r1如权利要求1所述。
22、一种同时响应胞外和胞内酸环境的两亲性嵌段聚合物，所述聚合物为线性两亲性嵌段聚合物，具有肿瘤胞外、胞内酸激活核磁共振信号引导成像特性，其具有以下式2所示结构：
23、
24、其中，
25、r2为n,n-二乙基氨基、n,n-二异丙基氨基、n,n-二叔丁基氨基、n-乙基正丙氨基、n,n-二丙氨基、n,n-二戊氨基、n,n-二己氨基、五亚甲基氨基、六亚甲基氨基或七亚甲基氨基，优选地为n,n-二异丙基氨基；r3为n,n-二乙基氨基、n,n-乙基丙氨基、五亚甲基氨基或六亚甲基氨基；优选为n,n-乙基丙氨基；
26、m为gd3+、mn2+、co2+、fe3+、cu2+或ni2+,优选地为gd3+；
27、n为20-200的整数，优选地为113的整数；
28、x为20-100的整数，优选地为40-50的整数；
29、y为20-100的整数，优选地为40-50的整数；
30、z为0-20的整数，优选地为5-10的整数。
31、一种所述的两亲性嵌段聚合物的制备方法，通过以下反应路线ii所示的可逆加成-断裂链转移聚合以及酯化接枝合成所述的两亲性嵌段聚合物：
32、
33、其中，n、x、y、z、m的定义如权利要求2所述；
34、步骤a：合成聚乙二醇-b-聚r3
35、将raft链转移剂封端的聚乙二醇大分子引发剂与甲基丙烯酸乙酯修饰的r3及引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1∶50-80∶0.1的比例溶于1-5毫升n,n-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用1-10毫升dmf稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到胞外酸响应两亲性嵌段共聚物；
36、
37、步骤b：聚乙二醇-b-聚(r3-b-r2-r-甲基丙烯酸羟乙酯)
38、取所述步骤a中得到的两亲性嵌段共聚物、甲基丙烯酸乙酯修饰的r2、甲基丙烯酸羟乙酯单体及引发剂偶氮二异丁腈以摩尔比＝1∶50-80∶10-20∶0.1的比例溶于1-5毫升n,n-二甲基甲酰胺；在无氧条件下，70℃反应24h，反应产物用1-10毫升dmf稀释后去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥，得到胞外、胞内酸响应两亲性嵌段共聚物；
39、
40、步骤c：取所述步骤b中得到的两亲性嵌段共聚物溶于无水n,n-二甲基甲酰胺，得到质量浓度为10％w/v的溶液c，将金属离子配位的焦脱镁叶绿酸(mppa)、n,n-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺以摩尔比为1∶1.5∶1.5∶1.5溶于n,n-二甲基甲酰胺中制得30％w/v溶液d，反应1.5h；将溶液c滴加到溶液d中，继续反应24h，然后用n,n-二甲基甲酰胺透析，再用去离子水透析，截留量为3500道尔顿的透析袋，冷冻干燥得到金属离子配位焦脱镁叶绿酸(mppa)共价修饰得到式2所示的两亲性嵌段聚合物；
41、
42、一种区域选择性递送系统，所述递送系统是由所述点击型共价药物和所述两亲性嵌段聚合物共同组装成的纳米粒；所述纳米粒响应肿瘤胞外微酸和胞内酸环境实现药物区域选择性递送；其中，所述点击型共价药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述两亲性嵌段聚合物占纳米粒总质量的80％-95％。
43、一种上述的区域选择性递送系统制备方法，首先将式1所示的点击型共价药物和式2所示的两亲性嵌段聚合物以质量比＝1-9的比例同时溶于有机溶剂中，得到混合溶液，在超声条件下将所述混合溶液滴加到去离子水中，与去离子水的体积比为1∶9，通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的式1所示的点击型共价药物，得到包载有式1所示的点击型共价药物区域选择性递送系统。
44、又一种区域选择性递送系统，所述递送系统是由所述点击型共价药物、正常药物和所述两亲性嵌段聚合物组装成的纳米粒，所述正常药物包括免疫调剂剂、化疗药物、核酸药物或蛋白降解剂；其中，所述点击型共价药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述正常药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述两亲性嵌段聚合物占纳米粒总质量的60％-90％。
45、一种上述的区域选择性递送系统制备方法，通过ph梯度法制备而成；首先，将正常药物和式2所示的两亲性嵌段聚合物以质量比＝1-9的比例同时溶于有机溶剂中，得到含有药物和所述两亲性嵌段聚合物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液滴加到ph>6.5的缓冲液中，与缓冲液的体积比为1∶9，通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的正常药物，得到包载有正常药物的纳米粒悬液；其次，将式1所示的点击型共价药物溶于有机溶剂，得到含有点击型共价药物的药物溶液，与纳米粒悬液的质量比＝1-9，且与ph>6.5纳米粒悬液的体积比为1∶9；在超声条件下将所述的药物溶液滴加到ph>6.5纳米粒悬液中，同时调节纳米粒悬液的ph至7.4，然后通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的点击型共价药物，最终得到含有所述点击型共价药物、正常药物和所述两亲性嵌段聚合物的纳米粒即区域选择性递送系统。
46、进一步，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；所述缓冲液选自pbs缓冲液。
47、一种所述的区域选择性递送系统在递送治疗癌症药物中的用途。
48、所述治疗癌症药物包括蛋白抑制剂、化疗药物、核算药物以及联合药物。
49、所述癌症为肺癌，皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或前列腺癌。
50、所述区域选择性递送系统具有肿瘤胞内、外区域选择性递送的特征，基于肿瘤胞外和胞内酸环境的差异性，将点击型膜蛋白抑制剂特异性在肿瘤胞外释放，特异性降解肿瘤细胞膜蛋白；将核磁共振造影剂特异性在胞内释放。区域选择性纳米粒在正常生理条件下(如ph＝7.4)自组装成稳定的纳米粒，流体力学粒径约80纳米；在血液循环时具有良好的稳定性，防止药物泄露；在肿瘤组织胞外微酸环境下，胞外酸激活纳米粒中胞外酸响应基团被质子化，释放出点击型共价药物，与叠氮预标记的肿瘤细胞发生点击反应，形成共价键，增强在肿瘤组织的滞留以及提高点击型共价药物的效力，减少毒副作用；待纳米粒被细胞摄取后，胞内酸激活纳米粒中胞内酸响应基团被质子化，在胞内激活核磁共振造影剂，最终实现药物区域选择性释放，实现核磁共振成像引导的肿瘤精准治疗。
51、本发明还提供了一种基于肿瘤胞外、胞内酸环境激活的点击型共价药物纳米平台肿瘤协同治疗药物，同时调控肿瘤胞内、外靶点；所述胞外微酸环境激活纳米粒用于调控肿瘤胞外靶点；胞内酸环境激活纳米粒用于调控胞内靶点，从而实现肿瘤精准治疗。其中，胞外微酸环境激活纳米粒释放点击型共价药物用于选择性共价降解肿瘤膜蛋白；胞内酸激活纳米粒释放其他药物调控胞内靶点；或者满足本发明用途任意治疗剂组合。
52、包含式1点击型共价药物和式2胞外、胞内酸响应两亲性嵌段聚合物的区域选择性纳米粒通过ph梯度方法制备，具有多层结构，包括聚乙二醇外层、聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯)-b-聚(n,n-二异丙基氨基乙酯-r-金属配位焦脱镁叶绿酸a)内层纳米粒，该纳米粒的平均流体力学粒径优选为70-120纳米。
53、所述的纳米粒具有肿瘤胞外、胞内酸环境响应功能，使相应的纳米粒具备肿瘤组织区域选择性递送药物的特征。聚乙二醇亲水层，能够防止蛋白吸附，使纳米粒在血液循环中保持稳定，减少内皮网状系统的清除，延长血液循环时间。纳米粒通过epr效应到达肿瘤组织后，甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯被质子化，纳米粒解离，暴露点击型共价药物，通过原位点击反应提高点击型共价药物在肿瘤组织的滞留；待纳米粒被肿瘤细胞摄取后，n,n-二异丙基氨基乙酯被继续质子化，释放出核酸或化疗等药物，最终实现药物区域选择性递送。
54、根据本发明提供的负载点击型共价药物和/或核酸药物、化疗药物、蛋白降解剂等的胞外、内酸响应纳米粒在治疗癌症中的用途，所述的癌症类型主要为乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌或前列腺癌等。
55、本发明的有益效果包括：
56、1)本发明利用点击化学和肿瘤胞外、内酸响应两亲性嵌段聚合物，精准实现肿瘤区域选择性递送；胞外酸激活递送点击型共价药物，通过和叠氮标记的肿瘤细胞发生点击反应共价抑制肿瘤靶蛋白，提高小分子效力，增强在肿瘤滞留，改善治疗效果，同时减少毒副作用；胞内酸激活递送核酸药物、化疗药物或蛋白降解剂，协同调控肿瘤胞内、外靶点。
57、2)本发明关键技术创新在于通过点击化学设计点击型共价药物，对叠氮标记的肿瘤细胞实现共价抑制，而对未叠氮标记的正常细胞没有影响，减少对正常组织的毒副作用。
58、3)本发明的创新独特性在于利用肿瘤胞内、外酸激活纳米粒响应肿瘤酸环境精准胞内、外区域选择性递药物，系统调控肿瘤包内外靶点，使得本发明具有广谱性，可应用于多种实体肿瘤治疗场景。
1.一类点击型共价药物，其特征在于，所述点击型共价药物能够与叠氮标记的靶蛋白发生点击反应形成共价键，其具有以下式1所示结构：
2.一种权利要求1所述点击型共价药物的制备方法，其特征在于，该方法具体包含如下步骤，通过以下反应路线i所示的酯化反应合成所述的点击型共价药物：
3.一种同时响应胞外和胞内酸环境的两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述聚合物为线性两亲性嵌段聚合物，具有肿瘤胞外、胞内酸激活核磁共振信号引导成像特性，其具有以下式2所示结构：
4.一种权利要求3所述的两亲性嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，通过以下反应路线ii所示的可逆加成-断裂链转移聚合以及酯化接枝合成所述的两亲性嵌段聚合物：
5.一种基于权利要求1所述药物及权利要求2所述聚合物的区域选择性递送系统，其特征在于，所述递送系统是由所述点击型共价药物和所述两亲性嵌段聚合物共同组装成的纳米粒；所述纳米粒响应肿瘤胞外微酸和胞内酸环境实现药物区域选择性递送；其中，所述点击型共价药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述两亲性嵌段聚合物占纳米粒总质量的80％-95％。
6.一种权利要求5所述的区域选择性递送系统制备方法，其特征在于，首先将式1所示的点击型共价药物和式2所示的两亲性嵌段聚合物以质量比＝1-9的比例同时溶于有机溶剂中，得到混合溶液，在超声条件下将所述混合溶液滴加到去离子水中，与去离子水的体积比为1∶9，通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的式1所示的点击型共价药物，得到包载有式1所示的点击型共价药物区域选择性递送系统；其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种。
7.一种基于权利要求1所述药物及权利要求2所述聚合物的区域选择性递送系统，其特征在于，所述递送系统是由所述点击型共价药物、正常药物和所述两亲性嵌段聚合物组装成的纳米粒，所述正常药物包括免疫调剂剂、化疗药物、核酸药物或蛋白降解剂；其中，所述点击型共价药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述正常药物占纳米粒总质量的5％-20％，所述两亲性嵌段聚合物占纳米粒总质量的60％-90％。
8.一种权利要求7所述的区域选择性递送系统制备方法，其特征在于，通过ph梯度法制备而成；首先，将正常药物和式2所示的两亲性嵌段聚合物以质量比＝1-9的比例同时溶于有机溶剂中，得到含有药物和所述两亲性嵌段聚合物的混合溶液，在超声条件下将该混合溶液滴加到ph>6.5的缓冲液中，与缓冲液的体积比为1∶9，通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的正常药物，得到包载有正常药物的纳米粒悬液；其次，将式1所示的点击型共价药物溶于有机溶剂，得到含有点击型共价药物的药物溶液，与纳米粒悬液的质量比＝1-9，且与ph>6.5纳米粒悬液的体积比为1∶9；在超声条件下将所述的药物溶液滴加到ph>6.5纳米粒悬液中，同时调节纳米粒悬液的ph至7.4，然后通过超滤或透析法除去有机溶剂或未包载的点击型共价药物，最终得到含有所述点击型共价药物、正常药物和所述两亲性嵌段聚合物的纳米粒即区域选择性递送系统；其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；所述缓冲液选自pbs缓冲液。
9.一种权利要求5或7所述的区域选择性递送系统在递送治疗癌症药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述治疗癌症药物包括蛋白抑制剂、化疗药物、核算药物以及联合药物；
