本发明涉及水产品鉴定，具体涉及一种基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法。
背景技术：
1、草鱼（ ctenopharyngodon idellus）是我国主要的淡水养殖经济鱼类，因其肉质细嫩、生长迅速且产量高，在池塘、湖泊和水库等养殖水域中占据着重要地位。近年来随着草鱼养殖规模的迅速扩张，尽管产量显著提升，但其品质的普遍下降已成为制约草鱼产业持续健康发展的关键问题。当前，在消费者对食品安全和品质要求日益提高的背景下，对鱼肉的消费需求已经从单纯追求数量转向追求品质与风味。因此，具有优良肉质和高营养价值的草鱼产品更受消费者的青睐。
2、抗病草鱼是一种优质草鱼品种，该品种是通过将锦鲤精子诱导的雌核发育草鱼与选育的雄性草鱼进行回交培育获得的，其不仅具备生长快、产量高和抗病能力强的优点，更在肌肉品质方面表现出优势，具有独特的风味和口感。然而，部分不法商贩为了牟取暴利，将池塘养殖的普通草鱼冒充抗病草鱼销售，严重扰乱了市场秩序。由于缺乏草鱼品种鉴别和鱼肉品质评价的有效标准，生产者难以将养殖的优质抗病草鱼产品以合理的价格推向市场，消费者也难以区分不同品种和品质的草鱼产品，监管部门在遇到以次充好等违规行为的投诉时，也往往束手无策。这使得抗病草鱼的市场推广和品质认证面临挑战。目前，鱼肉品种的鉴别主要采用分子生物学的鉴定方法。虽然分子生物学鉴定方法具有较高的准确性和可靠性，但操作复杂，不适用于大批量样品的实时鉴别，且无法获得鱼肉的风味特征并反映鱼肉品质。为了解决上述问题，亟需建立一种能够快速、准确鉴别抗病草鱼及其肌肉特征风味物质的方法，为抗病草鱼的市场推广和品质认证提供技术支撑。
3、近年来，全二维气相色谱-飞行时间质谱分析技术（gc×gc-tofms）因其分辨率高、灵敏度高、峰容量大和采集频率高等优点，已成为分析复杂样品中挥发性物质的有力工具。该技术在动植物品种鉴别、品质评价和资源鉴定等领域展现出广阔的应用前景。鉴于此，本发明提出一种基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，实现对抗病草鱼的快速、准确鉴别，并筛选出其差异挥发性物质。该方法对抗病草鱼的市场推广和品质认证提供了有效的技术手段，具有重要的现实意义和潜在的应用价值。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法。该方法通过提取和分析抗病草鱼与普通草鱼肌肉中的挥发性风味物质。通过多元统计分析方法，构建基于挥发性风味物质的草鱼鉴别模型，从而实现抗病草鱼的快速鉴别，并筛选出其差异挥发性物质。
2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
3、一种基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，包括以下步骤：
4、（1）称取待测鱼肌肉样品，经过破碎后转移至顶空瓶中，通过固相微萃取（spme）法提取肌肉样品中的挥发性风味物质（vocs）；
5、（2）通过全二维气相色谱-飞行时间质谱（gc×gc-tofms）技术分析步骤（1）所提取的挥发性物质；
6、（3）将步骤（2）采集的未知挥发性物质质谱数据与nist2020数据库中标准样品的质谱信息进行比对，以此确定挥发性物质的种类；以氘代正己醇溶液为内标，采用内标归一化法对检出的挥发性物质进行定量分析；
7、（4）将步骤（3）获得的挥发性物质定性定量数据与抗病草鱼/普通草鱼的差异鉴别分析模型和差异挥发性物质进行比对，即实现抗病草鱼和普通草鱼的品种及肌肉特征风味物质的鉴定。
8、上述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，优选的，所述抗病草鱼是一种优质草鱼品种，由锦鲤精子诱导的雌核发育草鱼与选育的雄性草鱼回交培育而成，而所述普通草鱼为长江水域草鱼原种。
9、优选的，步骤（1）中，所述肌肉样品取自鱼类背部侧线上方、背鳍下方的肌肉；所述固相微萃取条件为：使用自动取样器进行样品处理，将肌肉样本置于顶空进样瓶中，随后加入10μl内标溶液，在70-90℃下孵育10-20min；吸附样本前，spme萃取头（dvb/car/pdms萃取头，50/30μm×1cm）在260-280℃条件下老化10-15min；随后，在70-90℃条件下，spme萃取头吸附样本20-30min；吸附结束后，将spme萃取头转移至gc进样口，在240-260℃条件下脱附5-10min。
10、优选的，步骤（2）中，所述全二维气相色谱条件为：使用高纯氦气作为载气，恒定流速为1.0ml/min；一维色谱柱db-heavywax的升温程序为：初始温度40-50℃，保持2-5min，以3-5℃/min的速度升至220-250℃，保持4-6min；二维色谱柱rxi-5silms的升温程序比一维色谱柱高5℃，调制器温度始终高于二维色谱柱柱温15℃，调制周期为5-10秒；进样口温度为240-270℃。
11、优选的，步骤（2）中，所述飞行时间质谱分析条件为：质谱传输线温度为230-270℃，离子源温度为230-270℃，采集速率为150-200spectra/s，电子轰击源为70ev，检测器电压为2021v，质谱扫描范围为m/z35-550。
12、优选的，步骤（3）中，采用chromatof软件将采集的未知挥发性化合物的质谱数据与nist2020数据库的质谱信息进行比对，并结合化合物质谱图、化合物保留指数和标准保留指数进行定性分析，以此确认检出的挥发性化合物；以氘代正己醇溶液为内标，采用内标归一化法计算检出的挥发性化合物的相对含量，将检出化合物的峰面积与内标化合物的峰面积之比，乘以内标化合物的已知浓度，得到检出化合物的相对浓度。
13、优选的，在步骤（4）中，所述抗病草鱼/普通草鱼的差异鉴别分析模型的构建方法包括如下步骤：
14、（11）分别称取抗病草鱼和普通草鱼的肌肉样品，经过破碎后转移至顶空瓶中，通过固相微萃取法提取肌肉样品中的挥发性风味物质；
15、（12）通过全二维气相色谱-飞行时间质谱技术分析步骤（11）所提取的挥发性物质；
16、（13）将步骤（12）采集的挥发性物质质谱数据与nist2020数据库中标准样品的质谱信息进行比对，以此确定挥发性物质的种类；以氘代正己醇溶液为内标，采用内标归一化法对检出的挥发性物质进行定量分析；
17、（14）利用simca-p软件对获得的挥发性物质定性定量数据进行预处理，然后通过主成分分析（pca）实现抗病草鱼和普通草鱼的初步区分，并评估组内样本的变异度；采用正交偏最小二乘法判别分析（opls-da）对所得的挥发性物质定性定量数据进一步处理，并构建基于挥发性风味物质的正交偏最小二乘判别分析模型作为区分抗病草鱼和普通草鱼的鉴别模型。
18、优选的，所述抗病草鱼/普通草鱼的差异挥发性物质的筛选方法包括如下步骤：在步骤（11）-（14）的基础上，再通过正交偏最小二乘判别分析模型筛选与品种相关的差异挥发性物质并生成可视化的热图，具体筛选条件为vip>1.75，fc≥2或≤0.5，且t检验p<0.05，筛选出的若干差异挥发性物质作为区分抗病草鱼和普通草鱼的肌肉特征风味物质。
19、更优选的，总共筛选出28种差异挥发性物质，其中：
20、抗病草鱼相比于普通草鱼上调的挥发性物质包括（8种）：5-甲基-5-壬醇、3,5-二叔丁基-2-羟基苯甲腈、7-甲基十五烷、3,5-二甲基十一烷、3-乙酰庚烷-2,6-二酮、壬酰胺、2,3-二甲基-2-（丙-2-基）丁酸、1h-isoindole,3-methoxy-4,7-dimethyl-中的任意一种或多种；
21、抗病草鱼相比于普通草鱼下调的挥发性物质包括（20种）：9,12,15-十八碳三烯、2,4-己二烯醛、丁醛、十一烷基苯、4-乙基苯甲醛、1-甲基-1,2,3,4-四氢萘、壬烷肼、丙酸乙酯、辛-1,4-二烯、2-甲基-1-辛烯-3-炔、1-辛烯、1,2-乙烯基环己烷、5-甲基壬烷、2-戊基-2-环戊烯-1-酮、 (3e,5e)-壬-3,5-二烯-2-酮、1-甲基-1h-吡唑-3-羧酸甲酯、dihexyverine、4-甲氧基丁-2-酮、2,5-二甲基-1,5-己二烯-3-醇、zonarene中的任意一种或多种。
22、本发明的有益效果为：
23、1、本发明将固相微萃取技术与全二维气相色谱-飞行时间质谱技术（gc×gc-tofms）相结合，首次应用于草鱼品种鉴别和风味物质分析；固相微萃取技术用于提取和富集草鱼肌肉中的挥发性物质，具有无需复杂样品前处理、操作简便、耗时短、灵敏度高且重现性好的优点，能够提取更多种类和数量的挥发性物质；相比传统的气相色谱-质谱法（gc-ms），gc×gc-tofms技术展现了更高的峰容量、分离能力和灵敏度，显著提升了挥发性物质检测的准确性，获得的风味物质信息更加全面，尤适用于批量样品的快速鉴别与检测。
24、2、本发明通过多元统计分析构建了抗病草鱼鉴别模型，并通过opls-da模型筛选出差异挥发性物质作为潜在生物标志物，生成可视化的热图，该方法不仅能区分抗病草鱼与普通草鱼品种间的差异，更实现了抗病草鱼的挥发性风味物质分析和品质评价，为草鱼品种鉴定、育种以及品质评价提供了一种高效且可靠的方法。
1.一种基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，所述抗病草鱼是由锦鲤精子诱导的雌核发育草鱼与雄性草鱼回交培育而成，所述普通草鱼为长江水域草鱼原种。
3.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述肌肉样品取自鱼类背部侧线上方、背鳍下方的肌肉；所述固相微萃取条件为：使用自动取样器进行样品处理，将肌肉样本置于顶空进样瓶中，随后加入内标溶液，在70-90℃下孵育10-20min，吸附样本前，spme萃取头在260-280℃条件下老化10-15min；随后，在70-90℃条件下，spme萃取头吸附样本20-30min；吸附结束后，将spme萃取头转移至gc进样口，在240-260℃条件下脱附5-10min。
4.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述全二维气相色谱的色谱柱采取gc×gc柱系统：一维色谱柱为db-heavywax型色谱柱；二维色谱柱为：rxi-5silms型色谱柱。
5.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述全二维气相色谱条件为：使用高纯氦气作为载气；一维色谱柱db-heavywax的升温程序为：初始温度40-50℃，保持2-5min，以3-5℃/min的速度升至220-250℃，保持4-6min；二维色谱柱rxi-5silms的升温程序比一维色谱柱高5℃，调制器温度始终高于二维色谱柱柱温15℃，调制周期为5-10秒，进样口温度为240-270℃。
6.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述飞行时间质谱分析条件为：质谱传输线温度为230-270℃，离子源温度为230-270℃，采集速率为150-200spectra/s，质谱扫描范围为m/z35-550。
7.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用chromatof软件将采集的挥发性物质质谱数据与nist2020数据库的质谱信息进行比对，并结合化合物质谱图、化合物保留指数和标准保留指数进行定性分析，以此确认检出的挥发性化合物；以氘代正己醇溶液为内标，采用内标归一化法计算检出的挥发性化合物的相对含量，将检出化合物的峰面积与内标化合物的峰面积之比，乘以内标化合物的已知浓度，得到检出化合物的相对浓度。
8.根据权利要求1所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述抗病草鱼/普通草鱼的差异鉴别分析模型的构建方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于，所述抗病草鱼/普通草鱼的差异挥发性物质的筛选方法包括如下步骤：在步骤（11）-（14）的基础上，再通过正交偏最小二乘判别分析模型筛选与品种相关的差异挥发性物质并生成可视化的热图，具体筛选条件为vip>1.75，fc≥2或≤0.5，且t检验p<0.05，筛选出的若干差异挥发性物质作为区分抗病草鱼和普通草鱼的肌肉特征风味物质。
10.根据权利要求9所述的基于gc×gc-tofms技术快速鉴定草鱼品种及肌肉特征风味物质的方法，其特征在于：
