本发明涉及微生物，尤其涉及一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的复合酶及其制备方法与应用。
背景技术：
1、稀有人参皂苷compound k(ck)，是非天然人参皂苷，主要由其他二醇型人参皂苷转化而来，具有良好的生物活性，包括抗肿瘤、抗皮肤衰老、抗过敏和抗炎等，用途广泛、经济效益高。
2、目前，制备人参皂苷ck的方法主要有微生物发酵法和酶解法。专利cn106047978a是以微生物发酵法制备得到人参皂苷ck，该专利以紫芝为发酵菌进行发酵培养，在发酵至少3天后添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵得到稀有人参皂苷ck，发酵6天稀有人参皂苷ck产量最高，平均可以达到11.415mg/ml。尽管该方法能够在实验室中得到产量较高的人参皂苷ck，但是在工业生产中，存在与之相配套、可行的生产设备，无法实现人参皂苷ck的大批量生产。
3、专利cn105296587b是以酶解法制备得到人参皂苷ck，以双歧杆菌产生的β-葡萄糖苷酶与浓度为10mg/ml人参皂苷rb1反应生成人参皂苷ck，人参皂苷ck的转化效率为62-68％，然而，该专利的底物浓度为1％(10mg/ml)，不符合工业化生产的要求。在工业化生产中，底物浓度若低于10％会导致转化后生产的人参皂苷ck由于浓度过低，在反应釜中加热、搅拌，以及后续纯化、萃取、旋蒸等处理步骤中都会导致人参皂苷ck造成大量损失，同时消耗大量电能，使得生产成本大幅提高。与此同时，大部分β-葡萄糖苷酶的在微生物中的表达量低、稳定性差，只能在底物浓度低的情况下进行酶解，一旦底物浓度升高则酶的浓度和活性不足以支持高浓度底物的转化，无法高效转化人参皂苷ck。
4、专利cn 108138212 b是以酶解法制备得到人参皂苷ck，以棘孢曲霉和里氏木霉菌产生的果胶酶与人参精制皂苷反应生产人参皂苷ck，对酶解液进行加热使酶失活、加入乙酸乙酯提取，并采用硅胶柱色谱法分离得到人参皂苷ck。该方法采用多种有机溶剂以及生产工艺繁多，对环境造成负担、生产成本高。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的复合酶及其制备方法与应用。本发明还提供了一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的方法，能够提高人参皂苷rb1转化为人参皂苷ck的转化率，适合工业化生产，所制备得到的人参皂苷ck具有电导率低、稳定性好的优点。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
3、第一方面，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
4、a1、对来源于土壤中华单胞菌的β-葡萄糖苷酶进行密码子优化，通过基因编辑技术制备得到带有编码序列的表达载体，所述密码子优化后的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；
5、a2、将步骤a1所述表达载体转化至大肠杆菌中，通过筛选及鉴定得到阳性克隆；
6、a3、将步骤a2所得阳性克隆制备为二级种子液，利用二级种子液进行分批补料发酵，得到发酵液；
7、a4、对步骤a3所得发酵液进行离心，收集菌体沉淀，对所得菌体沉淀进行破碎、离心、浓缩和冻干处理，得到β-葡萄糖苷酶。
8、本发明复合酶所采用的β-葡萄糖苷酶由发明人自行生产获得。人参皂苷酶解转化途径为：rb1→rd→f2→ck，不同的酶具有不同的限速位点。如商业复合酶的限速位点为f2，导致大量原料聚集在f2→ck阶段，从而降低了ck的整体转化率；而本发明自产的β-葡萄糖苷酶，是在商业酶的缺点基础上，通过计算机软件辅助设计、定向优化制备得到的特殊ck转化酶，它的限速位点在rd→f2阶段。将该β-葡萄糖苷酶与其他酶进行互补使用，能有效避免所有限速位点的影响，实现稀有人参皂苷ck的高效转化。目前本发明自产的β-葡萄糖苷酶，通过发酵工艺的优化，所得到的成品酶活可达到12000u/g及以上，是实现对传统商业酶有效补充的关键。
9、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤a3中，所述分批补料发酵包括以下操作：
10、b1、将二级种子液接种至发酵培养基中，调节ph＝6.6-7.0，温度设置为35-37℃；所述二级种子液与发酵培养基的体积比为二级种子液：发酵培养基＝(0.8-1):30；
11、b2、当溶氧下降至60-70％时，调温至23-27℃并开始补料，第一小时补料速度190-200ml/h，第二小时补料速度220-230ml/h，第三小时补料速度250-260ml/h并维持不变；通过控制罐压，转速，通空气量以控制溶氧慢慢下降至12-18％；补料后每4h取样检测发酵液的od600值，当od600值不再上升时结束发酵。
12、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤b1中，所述发酵培养基的配方为：酵母浸粉10g/l、柠檬酸1g/l、磷酸二氢钾6g/l、硫酸铵5g/l、七水硫酸镁1g/l、磷酸氢二钾16g/l、蛋白胨8g/l、复配维生素0.1g/l、葡萄糖7g/l，接种前按发酵液体积添加卡那霉素至终浓度为20μg/ml。
13、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤b2中，所述补料为20wt％灭菌乳糖溶液。
14、第二方面，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶，主要由上述制备方法制备得到。
15、第三方面，本发明提供了一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的复合酶，包括β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的重量比为β-葡萄糖苷酶：果糖基转移酶：乳糖酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶＝(0.05-0.2)：(0.005-0.2)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.02-0.1)；
16、所述β-葡萄糖苷酶为上述β-葡萄糖苷酶。
17、本发明通过选取β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶搭配得到复合酶，能够在酶工程工艺中制备人参皂苷ck，具有协同增效将人参皂苷rb1转化为人参皂苷ck的转化率提高的作用，并且人参皂苷ck的含量最高可达69.3％。
18、发酵工艺的痛点之一是微生物的生长状态难以控制，造成发酵水平在不同批次间浮动较大，导致稀有人参皂苷ck产量不恒定。同时，微生物发酵技术需要添加碳源、氮源增加了人参皂苷提取时的杂质含量，造成产品的不稳定。本发明通过复合酶技术，有效转化人参皂苷为稀有人参皂苷ck，同时酶的活性、浓度等参数能够精准控制，使得批次间人参皂苷ck的性质高度重复，提高了生产工艺的稳定性。
19、作为本发明所述复合酶的优选实施方式，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的重量比为β-葡萄糖苷酶：果糖基转移酶：乳糖酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶＝0.1：0.01：0.04：0.05：0.05。
20、在优选重量比下，本发明复合酶的人参皂苷ck转化效率更高。
21、作为本发明所述复合酶的优选实施方式，所述β-葡萄糖苷酶的酶活力为12000-13000u/g，所述果糖基转移酶的酶活力为2500-3000u/g，所述乳糖酶的酶活力为5500-6000u/g，所述纤维素酶的酶活力为9000-10000u/g，所述β-葡聚糖酶的酶活力为6000-6500u/g。
22、作为本发明所述复合酶的优选实施方式，所述β-葡萄糖苷酶的酶活力为12000u/g，所述果糖基转移酶的酶活力为3000u/g，所述乳糖酶的酶活力为6000u/g，所述纤维素酶的酶活力为10000u/g，所述β-葡聚糖酶的酶活力为6500u/g。
23、第四方面，本发明提供了上述复合酶的制备方法，将β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶混合得到复合酶。
24、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述复合酶混合后与磷酸钠缓冲液混合制备得到复合酶溶液，所述复合酶与磷酸钠缓冲液的重量比为复合酶：磷酸钠缓冲液＝1:15。
25、本发明复合酶的制备方法简单快捷，仅需将各个组分按照特定的重量比混合即可制备得到。
26、第五方面，本发明提供了上述复合酶在制备人参皂苷ck中的应用。
27、第六方面，本发明提供了一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的方法，包括以下步骤：
28、(1)将含有人参皂苷rb1的提取物与0.5-1mm磷酸缓冲液混合，加入上述的复合酶，调节ph＝6.0-6.5，于45-55℃、200-800rpm下酶解70-74h，得到酶解液，所述含有人参皂苷rb1的提取物与磷酸缓冲液的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：磷酸缓冲液＝1：(10-100)；
29、(2)对步骤(1)所得酶解液进行离心，收集沉淀a，将所得沉淀a与纯水混合后进行匀浆和离心，待上清液电导率＜100μs/cm时收集沉淀b；
30、(3)以体积百分比为40-95％的乙醇溶液作为溶剂与步骤(2)所得沉淀b混合制备为复溶液，对复溶液进行压滤、微滤和浓缩处理，得到高纯度稀有人参皂苷ck。
31、本发明人参皂苷ck的转化方法具有生产工艺简单、绿色环保的优点，避免了柱层析等复杂工艺，使用的试剂为水和乙醇，能够回收再利用。与此同时，市售50％含量的人参皂苷ck粉价格为36000-75000元/kg，本发明不需经过额外柱层析等纯化步骤生产得到含量在50％以上的稀有人参皂苷ck粉，每公斤成本在12000元以内，具有更高的经济效益。
32、在一般的工业化生产中，底物浓度低于10％会导致人参皂苷ck的含量过低，而本发明的转化方法中当底物浓度为1％时，每1000g人参皂苷rb1的提取物能够获得526g人参皂苷ck(含量为66.3％)，这是由于本发明采用特定的复合酶与人参皂苷rb1反应，复合酶中的高活力β-葡萄糖苷酶能够解除了人参皂苷ck途径中的限速，同时与其他酶协同增效，从而克服底物浓度低导致的人参皂苷ck得率低的问题，有效提高人参皂苷ck的转化率。
33、人参皂苷酶解转化途径为：rb1→rd→f2→ck，当rb1开始进一步转化生成的皂苷都为非水溶性皂苷，酶解过程中会形成膏状沉淀，不利于酶和膏状沉淀内部的rd和f2的接触，阻碍了ck的转化效率。本发明对酶解过程的转速进行优化，通过搅拌桨撞击分散沉淀，增加了酶分子和沉淀内部皂苷的接触频率，大大提高了ck的生物转化效率。
34、本发明的方法中增加了匀浆的步骤，通过引入匀浆离心工艺，将酶解转化的大量膏状物加纯水用匀浆机打散后，盐离子以及一些水溶性物质会分散于上清液中，离心匀浆液，弃去上清回收沉淀，能够进一步纯化产品，所制备得到的人参皂苷ck电导率低、颜色浅、澄清度高、稳定性高、杂质少，粉末暴露在空气中不易板结，可在化妆品中应用，适合水、乳、膏、霜等多种化妆品应用场景中。
35、在人参皂苷ck的酶解工艺中，酶残留是酶工程的痛点问题之一，常用的处理方法是通过高温加热使酶失活，但是这种处理，失活的酶以蛋白质杂质的形态仍旧存在于人参皂苷ck中，降低了其纯度；同时加热处理在一定程度上又会有破坏原料的稳定性、功效、颜色等风险。为了解决上述痛点问题，本发明通过水洗工艺(即加入纯水进行匀浆以及采用乙醇水溶液复溶)，将溶于水的酶除去，留下不溶于水的ck，实现了非加热、无蛋白残留的酶去除。
36、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述调节ph＝6.0，于50℃、400-800rpm下酶解72h，得到酶解液。
37、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述含有人参皂苷rb1的提取物与磷酸缓冲液的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：磷酸缓冲液＝1：(10-90)。
38、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述含有人参皂苷rb1的提取物与磷酸缓冲液的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：磷酸缓冲液＝1：(20-50)。
39、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述含有人参皂苷rb1的提取物与磷酸缓冲液的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：磷酸缓冲液1:50。在优选重量比下，本发明所制备得到的人参皂苷ck含量为69.3％。
40、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，含有人参皂苷rb1的提取物与复合酶的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：复合酶＝1：(0.095-0.7)。
41、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，含有人参皂苷rb1的提取物与复合酶的重量比为含有人参皂苷rb1的提取物：复合酶＝1：0.25。
42、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述复合酶在加入前与ph＝6.5-7.5、0.5-1mm的磷酸缓冲液配置为复合酶溶液，所述复合酶与磷酸缓冲液的重量比为复合酶：磷酸缓冲液＝1：(10-15)。
43、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(1)中，所述复合酶在加入前与ph＝7.0、1mm的磷酸缓冲液配置为复合酶溶液，所述复合酶与磷酸缓冲液的重量比为复合酶：磷酸缓冲液＝1:10。
44、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(2)中，所述上清液电导率为1-90μs/cm时收集沉淀b。
45、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(2)中，所述沉淀a与纯水的重量比为沉淀a：纯水＝1：(10-50)。
46、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(2)中，所述沉淀a与纯水的重量比为沉淀a：纯水＝1：10。
47、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(3)中，所述乙醇溶液与沉淀b的重量比为1:(10-15)，所述乙醇溶液的体积百分比50-60％。
48、作为本发明所述应用的优选实施方式，在步骤(3)中，所述乙醇溶液与沉淀b的重量比为1:10，所述乙醇溶液的体积百分比50％。
49、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
50、1、本发明通过计算机软件模拟计算、密码子优化工艺，自主构建表达β-葡萄糖苷酶的菌株，优化生产工艺生产出高活力的β-葡萄糖苷酶，与果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶四种酶混合搭配使用，可以协同提高人参皂苷rb1的转化为人参皂苷ck的效率，适合人参皂苷ck的工业化大批量生产。
51、2、本发明通过对含人参皂苷rb1的提取物进行酶解、离心、匀浆、复溶、压滤、微滤、浓缩和干燥得到人参皂苷ck，简化了人参皂苷ck的制备流程，降低了生产成本，生产工艺简单、绿色环保，同时提高了人参皂苷ck的转化率，所得到的人参皂苷ck电导率低、颜色浅、澄清度高、稳定性高、杂质少，可在化妆品中应用。
1.一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，在步骤a3中，所述分批补料发酵包括以下操作：
3.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，主要由权利要求1或2所述制备方法制备得到。
4.一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的复合酶，其特征在于，包括β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的重量比为β-葡萄糖苷酶：果糖基转移酶：乳糖酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶＝(0.05-0.2)：(0.005-0.2)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.02-0.1)；
5.如权利要求4所述的复合酶，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基转移酶、乳糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶的重量比为β-葡萄糖苷酶：果糖基转移酶：乳糖酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶＝0.1：0.01：0.04：0.05：0.05。
6.如权利要求4或5所述的复合酶，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的酶活力为12000-13000u/g，所述果糖基转移酶的酶活力为2500-3000u/g，所述乳糖酶的酶活力为5500-6000u/g，所述纤维素酶的酶活力为9000-10000u/g，所述β-葡聚糖酶的酶活力为6000-6500u/g。
7.如权利要求4-6任一项所述的复合酶在制备人参皂苷ck中的应用。
8.一种高效转化高纯度稀有人参皂苷ck的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下(ⅰ)-(ⅲ)中的至少一种：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下(ⅳ)-(ⅴ)中的至少一种：
