本发明属于生物工程，具体涉及一种重组耐高温脂肪酶pfhl、表达该酶的重组菌株及其应用。
背景技术：
1、脂肪酶(lipase,ec 3.1.1.3)是一种三酰基甘油酯水解酶，其主要作用是在油水界面催化长链甘油三酯水解为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。除了能够催化甘油酯类化合物的水解之外，脂肪酶还可以用于催化酯合成、酯交换、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成以及药物的合成等方面，具有催化多样性和底物专一性等特征，在粮油生产、食品工业、造纸工业、日用化学工业、农业化学工业、洗涤剂工业以及药物合成等许多领域得到广泛应用。
2、脂肪酶在酶制剂中销量第三，仅次于蛋白酶和淀粉酶。目前工业应用的脂肪酶主要来源于酵母和细菌，最适温度和ph范围多为35～45℃和6.5～8.0，适应中低温和偏中性的应用环境。但中低温脂肪酶在工业应用中存在一些普遍问题，如高温或碱性等条件下易失活等，这在一定程度上限制了脂肪酶的工业应用。对于脂肪酸链长的水解特异性，目前已报道的绝大多数脂肪酶都是优先识别短链脂肪酸，仅有少数能催化长链脂肪酸发生反应，并且在实际生产过程中仍存在活性不高，热稳定性欠佳，特异性不高等问题。且随着微生物脂肪酶工业化应用的不断发展，市场对脂肪酶制剂的各项性质和指标却又提出了更高的要求，如对不同的最适温度和ph值、较高的温度稳定性和酸碱耐受性、理想的催化活性和反应专一性、非常规溶剂(有机溶剂、离子液体等)的耐受性等，因此仍然迫切需要挖掘及表征新型性能优良的脂肪酶制剂资源，使其能更好地满足工业需求。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种重组耐高温脂肪酶pfhl、表达该酶的重组菌株及其应用；本发明对脂肪酶基因进行密码子优化，然后基于优化后的基因设计了用于大量特异性扩增脂肪酶的引物，并构建了表达该酶的重组菌株，诱导表达，得到重组耐高温脂肪酶pfhl；所述重组耐高温脂肪酶pfhl最适催化反应温度为60℃，并且在50～80℃的温度范围下反应仍能保持80％的活性，在ph7.0～10.0的反应ph下反应仍能保持70％的活性；所述脂肪酶还具对中长链脂肪酸酯底物具有偏好特异性，利用脂肪酶水解甘油酯所产生的不同中长链脂肪酸具有不同的功能，具有很好的实用性。
2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：
3、本发明首先提供了一种重组耐高温脂肪酶pfhl，所述重组耐高温脂肪酶pfhl的氨基酸的序列如seq id no.2所示。
4、本发明还提供了编码上述重组耐高温脂肪酶pfhl的基因pfhl，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、本发明还提供了扩增上述pfhl的特异性引物对，所述引物对为：
6、ccgcgcggcagccatatgaacatggatgccagcac(seq id no:3)；
7、ggtgctcgagttacaggcctttgcttttcaggc(seq id no:4)。
8、本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因pfhl的核苷酸片段。
9、本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株在宿主菌中导入上述重组质粒；优选地，所述宿主菌包括大肠杆菌。
10、本发明还提供了重组耐高温脂肪酶pfhl在油脂改性、酯类合成、药物合成和造纸中的应用。
11、优选地，重组耐高温脂肪酶pfhl在应用时反应温度条件为50～80℃，反应ph条件为7.0～10.0。
12、一种用于生产低热量油脂的酶制剂，所述酶制剂包括上述重组耐高温脂肪酶pfhl。
13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
14、现有的微生物来源的天然脂肪酶仅仅具有35～45℃的最适反应温度，本发明利用基因工程技术获得一种重组耐高温脂肪酶pfhl，所述重组耐高温脂肪酶pfhl最适催化反应温度为60℃，并且在50～80℃的温度范围下反应仍能保持80％的活性，在ph7.0～10.0的反应ph下反应仍能保持70％的活性。本发明所述重组耐高温脂肪酶pfhl具有耐高温、ph作用范围广等突出优点，在各种工业领域将具有巨大的市场前景，更是对补充工业化生产应用的耐高温性脂肪酶种类具有重要意义，能更好的满足生产需求。
15、本发明制备所得的重组耐高温脂肪酶pfhl在高温条件下具有良好的稳定性，本发明的重组耐高温脂肪酶pfhl在50～70℃下孵育2h内残余酶活均保持在70％以上，在最适反应温度为60℃下孵育2h内残余酶活可保持在85％以上，具有良好的温度稳定性。此特性可广泛应用于在油脂改性、生物柴油、洗涤剂及造纸等工业领域，以解决在实际应用过程中温度对酶催化反应的限制问题，降低工业应用成本。如，在一些酯合成过程中，例如在催化合成一些植物甾醇酯、棕榈酸酯、维生素酯和香豆酸单萜酯等都需要在较高的温度下进行酯化反应，以获得其最大转化率；在生产环保型的生物基增塑剂时也需要脂肪酶作为催化剂，一般的反应温度在50-60℃；另外在造纸工业中，脂肪酶用于废纸脱墨时的碎浆温度和浮选温度一般在50-65℃，因此也需要脂肪酶具有耐热的特性；并且脂肪酶在加工过程中，在高温制粒、烘干等过程中会造成酶活损失，部分热稳定性差的脂肪酶活损失率高达80％以上。同时，在运输、储备等过程也需要酶制剂有足够的稳定性。因此本发明的重组耐高温脂肪酶能有效的降低工业生产成本，在高温下依然保持较强稳定性。
16、本发明所本发明制备所得的重组耐高温脂肪酶pfhl还具对中长链脂肪酸酯底物具有偏好特异性，利用脂肪酶水解甘油酯所产生的不同中长链脂肪酸具有不同的功能。中链脂肪酸可以广泛应用于医药、保健食用油及养殖业；长链饱和脂肪酸如棕榈酸和硬脂酸，主要用于生产作为乳化剂的脂肪酸盐；长链不饱和脂肪酸在代谢中具有广泛的生理活性，用于健康保健等，因此本发明制备的脂肪酶在食品、医药、保健及饲料工业等多个领域也具有良好的应用价值。
17、本发明技术方案中，所用的大肠杆菌表达菌株具有高水平的重组蛋白表达能力，表达水平高，发酵产酶条件温和，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有可持续发展的特点，对实际生产应用具有很好的推动作用。
1.一种重组耐高温脂肪酶pfhl，其特征在于，所述重组耐高温脂肪酶pfhl的氨基酸的序列如seq id no.2所示。
2.编码权利要求1重组耐高温脂肪酶pfhl的基因pfhl，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.扩增权利要求2所述的pfhl的特异性引物对，其特征在于，所述引物对为：
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因pfhl的核苷酸片段。
5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株在宿主菌中导入权利要求4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌。
7.权利要求1所述的重组耐高温脂肪酶pfhl在油脂改性、酯类合成、药物合成和造纸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，重组耐高温脂肪酶pfhl在应用时反应温度条件为50～80℃，反应ph条件为7.0～10.0。
9.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包括权利要求1所述的重组耐高温脂肪酶pfhl。
