本发明属于生物，涉及一种胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒，本发明还涉及所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒的制备方法及其在sars-cov-2病毒检测中的应用。
背景技术：
1、新型冠状病毒(sars-cov-2)，简称“新冠病毒”，是继sars-cov及mers-cov之后发现的第三种能够引起严重急性呼吸系统疾病的高致病性β属人冠状病毒。作为一种严重的流行疾病，新冠病毒的快速诊断至关重要，其检测方法主要包括病原学检测法、分子生物学检测法以及免疫学抗体、抗原检测法。抗原检测通常用于前期检测疑似感染新冠病毒的患者，主要检测新冠病毒结构蛋白核衣壳蛋白(nucleocapsid,n)或者刺突蛋白(spike,s)，两种结构蛋白均为新冠病毒的特异性蛋白，检测原理基于抗原抗体免疫反应或者是适配体杂交，采用比色、荧光、电化学等方式转换成检测信号。
2、侧向层析检测是一个基于纸张层析的平台，广泛用于快速和现场检测，其中基于抗原抗体免疫反应以实现检测结果的可称为测流免疫层析检测。作为一种较为常见的抗原检测方法，测流免疫层析检测将免疫检测和层析分离相结合，具有操作简单、成本低廉、易于携带、即时诊断等优点。胶体金，乳胶，铕，螯合负载的二氧化硅等有色试剂是侧向层析技术常用的颜色检测试剂，其中胶体金(金纳米颗粒，au)最为常用，基于胶体金法的新冠病毒抗原检测试剂盒就是新冠患者初期进行自我诊断的常见手段。胶体金抗原检测试纸条组成包括载体、包被有检测线(t线，含单克隆抗体)和质控线(c线，含抗抗体)的硝酸纤维膜、用于承载金标抗体(胶体金标记单克隆抗体)的金标垫、用于承接样品溶液的样品垫以及用于引导样品溶液依次穿过样品垫、金标垫和硝酸纤维素膜的吸水纸。检测时，待测样品滴加在样品孔中，在毛细作用下向前层析，当层析到t线时，有目标抗原存在则形成“抗体—抗原—金标抗体”复合物，从而出现一条红色反应线即为阳性；无红色反应线出现则为阴性。无论是否有目标抗原，c线都会出现一条红色反应线，以判定层析过程是否正常，检测是否有效。
3、水凝胶聚合物纳米颗粒是由c-c键链接而成的高分子聚合物，由各种功能单体通过自由基引发聚合反应形成，主链为c-c长链，侧链则为各种不同功能单体，常涉及的功能单体有丙烯酰胺以及甲基丙烯酸衍生物，如n-丙烯酰基-l-氨基酸、2-甲基丙烯酰基-l-氨基酸-nh2。水凝胶共聚物能否实现特异分子识别功能，关键就在于其侧链中引入的功能单体是否能提供与目标生物分子结合位点高度互补的疏水、氢键、静电、π-π堆积作用等多重相互作用，这些相互作用与功能单体所带的疏水性、亲水性和(或)带电性基团密切相关。由于各功能单体的种类和配比可调，使合成的水凝胶聚合物纳米颗粒具有更为广泛的化学多样性，利用此特点，可构建出结构和功能灵活多样的聚合物纳米颗粒文库。水凝胶聚合物纳米颗粒制备过程简单，成本低廉，一步合成法有助于其规模化和快速生产，稳定性和鲁棒性好，对ph、温度等外界环境具有很强的耐受能力，已被用于各种复杂体系中靶标生物分子的提取、分离、纯化和去除，更有望取代天然抗体在生物技术领域发挥特定的作用和功能。
4、人工合成聚合物纳米颗粒侧链中引入的功能单体，尤其是氨基酸单体，与蛋白抗体肽链中氨基酸侧基的结构和性质相似，其之所以能够特异性识别目标生物分子，达到与生物抗体/受体类似的功效，也正是因为其能够模拟天然生物大分子，如抗原-抗体之间特异性的多重互补相互作用(水合互补性，hydropathic complementarity)，使其具有类似于抗体识别抗原的功能，因此又被称作“聚合物仿生亲和配体”或者“非生物抗体”。因此，本发明利用sars-cov-2编码的结构蛋白如s蛋白，分析s蛋白与其宿主细胞受体结合的晶体结构信息以及分子识别机制，通过分子对接等手段，得到对s蛋白受体结合域(receptorbinding domain,rbd)具有较高亲和力的氨基酸功能单体，并调控候选功能单体的种类和配比，合成一系列具有不同结构和表面化学性质的聚合物纳米颗粒组成文库，通过对s蛋白rbd的亲和实验，从文库中筛选出结合能力更强的水凝胶聚合物纳米颗粒。利用这种基于理性设计与定向化学进化相结合的方法，最终获得对新冠病毒s蛋白具有高亲和力和高选择性的水凝胶聚合物仿生亲和配体。在此基础上，与胶体金原位聚合，得到具有核壳结构的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒，并基于抗原检测技术，建立由人工合成的非生物抗体代替生物抗体的侧向层析可视化检测平台，为sars-cov-2体外诊断与环境样本检测提供新的方法，为未来新发突发传染病疫情的快速响应提供更多可能。
技术实现思路
1、本发明的第一个目的是提供一种胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒，将其作为亲和探针，并利用其能与新冠病毒(sars-cov-2)的刺突蛋白(spike，s)及其受体结合域(receptor binding domain,rbd)特异性结合形成稳定复合物的特性，实现对sars-cov-2病毒抗原的非生物抗体快速识别与检测。
2、本发明提供的亲和探针，它是由非生物抗体外壳和示踪标记物内核形成的核壳结构，所述非生物抗体外壳是由n-丙烯酰基-l-色氨酸(atrp)、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺进行自由基链式聚合反应形成的水凝胶共聚物(atrp-nps)，所述示踪标记物内核是金纳米颗粒。
3、进一步地，所述n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺三者的摩尔比为20-80：15-80：1-5。
4、一种制备所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒(au@atrp-nps)的方法，包括以下步骤：首先对金纳米颗粒进行3-丁烯胺盐酸盐修饰，然后加入n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺，接着加入引发剂并在氮气保护下在金纳米颗粒表面进行自由基链式聚合反应，生成水凝胶共聚物原位并聚合在胶体金表面。
5、优选地，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
6、本发明进一步提供所述的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒在制备sars-cov-2病毒检测试纸条中的应用以及一种sars-cov-2病毒检测试纸条。
7、优选地，该试纸条是检测sars-cov-2病毒s蛋白的非生物抗体侧向层析试纸条，试纸条中含有所述的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒。
8、进一步优选地，该试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒滴加在样品垫上；所述质控线上含有表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒；所述检测线上含有待测样品溶液。
9、进一步优选地，所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒的使用浓度为0.01-0.2mg/ml，滴加体积为20-100μl。
10、进一步优选地，所述表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒是由2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2(mlys)、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺通过自由基链式聚合反应生成，所述n-烷基丙烯酰胺由n-异丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺组成，所述2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2、n-异丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺四者的摩尔比为20-40：15-35：30-50：1-5。
11、本发明的另一目的是提供一种sars-cov-2病毒非诊断目的检测方法，包括以下步骤：
12、s1、以金纳米颗粒作为示踪标记物内核，在其表面进行3-丁烯胺盐酸盐修饰，然后向金纳米颗粒中加入n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺以及引发剂，在氮气保护下进行自由基链式聚合反应，将反应得到的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒作为亲和探针并浓缩备用；
13、s2、向2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺中加入引发剂，在氮气保护下进行自由基链式聚合反应，合成表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒；
14、s3、将样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在支撑底板上，将待测样品溶液点在硝酸纤维素膜的检测线上，将步骤s2制备的表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒划在硝酸纤维素膜的质控线上，然后进行干燥；
15、s4、将步骤s1制备的亲和探针滴加到样品垫上进行侧向层析检测，若检测线和质控线同时显色，检测结果为sars-cov-2阳性；若检测线不显色，质控线显色，检测结果为sars-cov-2阴性。
16、本发明为了实现sars-cov-2病毒的非生物抗体检测，分别制备了两种水凝胶聚合物纳米颗粒，一种是以n-丙烯酰基-l-色氨酸为主要功能单体合成的水凝胶共聚物，并将其作为非生物抗体外壳包裹金纳米颗粒，形成一种胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒亲和探针(au@atrp-nps)，它能够特异性识别并结合sars-cov-2s蛋白的rbd结构域；另一种是以2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2为主要功能单体合成的水凝胶聚合物纳米颗粒(mlys-nps)，它基于静电作用与上述亲和探针结合，实现检测平台质控线(c)的应用。基于上述两种非生物抗体，建立侧向层析检测平台，采用直接法，实现新冠病毒的快速检测。
17、本发明构建的检测方法既可用于sars-cov-2病毒的疾病诊断，也能用于以非疾病诊断为目的的sars-cov-2病毒实验室筛查鉴定、环境检测等。
18、本发明的有益效果是：
19、本发明以水凝胶聚合物纳米颗粒作为非生物抗体特异性结合sars-cov-2s蛋白，该非生物抗体具有优异的亲和力，与生物抗体相比，它具有合成条件温和、制备过程简单、成本低廉、稳定性好，且具有较高的生物相容性和可塑性。
20、本发明建立的非生物抗体侧向层析可视化检测平台，以一种胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒亲和探针(au@atrp-nps)作为检测标准，以一种水凝胶聚合物纳米颗粒(mlys-nps)作为质控标准，整个检测平台无任何生物抗体，制备成本低廉、易于保存、稳定性好，用以替代原有的生物抗体，克服了生物抗体开发难度大、成本高、环境耐受性差、易失活、保存和反应条件严苛等限制；同时检测平台无需专门的判读仪器，反应时间短，仅需15～20min即可完成检测，结果直观读取，无需掌握复杂的专业知识，在定性和半定量检测方面也具有一定的应用潜力。
1.一种胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒，它是由非生物抗体外壳和示踪标记物内核形成的核壳结构，所述非生物抗体外壳是由n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺进行自由基链式聚合反应形成的水凝胶共聚物，所述示踪标记物内核是金纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒，其特征在于：所述n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺三者的摩尔比为20-80：15-80：1-5。
3.一种制备权利要求1所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒的方法，其特征在于：首先对金纳米颗粒进行3-丁烯胺盐酸盐修饰，然后加入n-丙烯酰基-l-色氨酸、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺，接着加入引发剂并在氮气保护下在金纳米颗粒表面进行自由基链式聚合反应，生成水凝胶共聚物并原位聚合在胶体金表面。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈。
5.权利要求1所述的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒在制备sars-cov-2病毒检测试纸条中的应用。
6.一种sars-cov-2病毒检测试纸条，该试纸条是检测sars-cov-2病毒s蛋白的非生物抗体侧向层析试纸条，试纸条中含有权利要求1所述的胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒。
7.如权利要求6所述的sars-cov-2病毒检测试纸条，其特征在于：该试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒滴加在样品垫上；所述质控线上含有表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒；所述检测线上含有待测样品溶液。
8.如权利要求7所述的sars-cov-2病毒检测试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的水凝胶聚合物纳米颗粒的使用浓度为0.01-0.2mg/ml，滴加体积为20-100μl。
9.如权利要求7所述的sars-cov-2病毒检测试纸条，其特征在于：所述表面带正电荷的水凝胶聚合物纳米颗粒是由2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2、n-烷基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺通过自由基链式聚合反应生成，所述n-烷基丙烯酰胺由n-异丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺组成，所述2-甲基丙烯酰基-赖氨酸-nh2、n-异丙基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺四者的摩尔比为20-40：15-35：30-50：1-5。
10.一种sars-cov-2病毒非诊断目的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
