本发明涉及生物检测，尤其是涉及一种牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组及其应用。
背景技术：
1、牛病毒性腹泻(bovineviraldiarrhea，bvd)是由牛病毒性腹泻病毒(bvdv)引起的一种广泛分布于世界各地的传染病，它给养殖业带来了巨大的经济损失。bvdv是一种严重影响世界范围内的养牛业的“重要病原体”。此病毒不仅导致直接经济损失，如临床症状引起的生产力损失和治疗成本增高，还会造成间接经济压力，例如由于隔离患病个体而导致的产量减少。据统计，在美国每年因bvd造成的经济损失估计高达6750万美元。此病不仅导致动物死亡率上升，还影响生长性能和生产效率，造成巨大的经济损失。bvdv属于黄病毒科瘟病毒属成员(pestivirus)，其可通过多种途径传播如直接接触、精液、奶汁或胎盘等。感染后可引起广泛的临床症状包括发热、消化道紊乱乃至繁殖障碍等问题，一项针对欧洲地区牧场调查的结果显示，在有记录的动物疫情中，bvd所占比例达到5-6％(2009)。这表明了这种病毒感染在全球畜牧业中的普遍性。目前常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验(elisa)，rt-pcr等，这些方法虽然具有较高的敏感性和特异性，但通常需要昂贵设备且操作复杂耗时长(grayetal.，2007)。随着对bvd认识加深和技术发展，一种名为lamp(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)的技术逐渐受到关注。lamp是一种等温核酸扩增技术，可以在特定温度下实现dna的大片段高效扩增。相对于传统的pcr方法，其操作更为简便并且设备要求较低，在现场使用时具有更高的灵活性。近年来的研究表明，基于lamp的分子生物学诊断方法已经成功应用于多种重要动物疫病的诊断当中，这些方法被证实非常敏感而且能在短时间内得出结论。举例来说，mukherjees.k等成功地利用lamp对奶样进行了bvdv rna的存在与否进行鉴定，结果显示这种方法可以有效地替代传统的pcr技术。张晓明等开发了一种针对m.bovis的lamp检测方法并证实其在现场条件下仍能保持良好的敏感性和特异性。据李华教授所述：相较于传统实验室诊断手段需要昂贵仪器与长时间等待结果相比，lamp更适合于养殖业者日常监测与早期干预的需求。这样不仅可以及时控制病毒扩散，还可以降低治疗成本提高经济效益。通过分析现有文献资料及案例研究，从该疾病的流行情况、病原学特点可以看出对于复杂的多病原性疾病--牛病毒性腹泻来说，采用先进的lamp技术能够有效提升检出速度和准确性，有利于实现实时监控和精准防治策略。
2、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组，以解决现有技术中缺少利用lamp技术快速精准的检测或鉴定牛病毒性腹泻病毒的技术问题。
2、本发明的目的之二在于提供上述的牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组在制备用于检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。
3、本发明的目的之三在于提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂。
4、本发明的目的之四在于提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。
5、第一方面，本发明提供一种牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组，包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb；
6、所述外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述内引物fip的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述内引物bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述环引物lf的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.6所示。
7、进一步的，所述外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb的摩尔比为1:1:3:3:1:1。
8、第二方面，本发明提供上述的牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组在制备用于检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。
9、第三方面，本发明提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂，包括前述实施方式所述的引物组。
10、进一步的，所述外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb的浓度分别独立地为5～10μm。
11、第四方面，本发明提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，包括前述实施方式所述的引物组或前述实施方式所述的试剂。
12、进一步的，还包括反应液、阴性对照品、阳性对照品和dna聚合酶；
13、进一步的，所述阳性对照品为携带牛病毒性腹泻病毒靶基因克隆的质粒dna；
14、优选地，所述阴性对照品为ddh2o。
15、进一步的，所述反应液包括mgcl2、甜菜碱、缓冲液和dntp；
16、优选地，所述mgcl2的浓度为20～25mm；
17、优选地，所述甜菜碱的浓度为5～10μm；
18、优选地，所述dntp的浓度为5～10mm；
19、优选地，所述缓冲液为10×buffer。
20、进一步的，所述dna聚合酶包括bst dna聚合酶或bst dna聚合酶大片段。
21、本发明提供的牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组，通过选取牛病毒性腹泻gb基因作为靶基因，设计特异性lamp引物组，外引物f3、外引物b3、内引物fip和内引物bip能够特异性完全识别靶基因，从而保证了其对牛病毒性腹泻病毒基因扩增的特异性和检测的全面性；同时与环引物配合提高其扩增效率；利用引物组可实现对牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组的快速检测，其检测灵敏度较普通pcr高，扩增模板浓度仅需102个拷贝或更小；采用lamp技术，不需特殊仪器或设备，只需放在一个55～65恒温环境中，30～60min即可完成靶基因的高效扩增；扩增产物进行pcr反应，阴阳性结果差异显著，通过扩增曲线及tt值进行结果的判定。另一方面，本发明提供的用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，利用上述的引物组或上述的试剂在30min内即可完成所述靶区域的高效扩增，并根据条件通过产物荧光反应进行结果的判定。其形成的试剂盒具有操作简单、特异性高、不需特殊设备、成本低廉、结果易判定，适用于现场快速检测、基层兽医临床诊断或疫病的监测。解决了现有技术中缺少利用lamp技术快速精准的检测或鉴定牛病毒性腹泻病毒的技术问题。
1.一种牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb；
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb的摩尔比为1:1:3:3:1:1。
3.权利要求1或2所述的牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组在制备用于检测牛病毒性腹泻病毒的产品中的应用。
4.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb的浓度分别独立地为5～10μm。
6.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求4或5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应液、阴性对照品、阳性对照品和dna聚合酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为携带牛病毒性腹泻病毒靶基因克隆的质粒dna；
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括mgcl2、甜菜碱、缓冲液和dntp；
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述dna聚合酶包括bst dna聚合酶或bst dna聚合酶大片段。
