本发明涉及一种益脑胶囊的一测双评等度洗脱hplc定量测定方法。即,采用普通的高效液相色谱仪，以等度洗脱的方式，同时测定益脑胶囊中的灵芝酸a、五味子醇甲含量。
背景技术：
1、益脑胶囊为国药准字z10983042的otc药，具补气养阴，滋肾健脑，益智安神之功效。用于神经衰弱，体倦头晕，失眠多梦。处方组成与制备工艺如下：
2、处方：龟甲胶38.6g 远志193.3g 龙骨387.3g 灵芝387.3g
3、五味子49.3g 麦冬193.3g 石菖蒲193.3g 党参111.0g
4、人参66.6g 茯苓387.3g
5、制备工艺：以上十味，除龟甲胶外，人参、茯苓(25％)分别粉碎成细粉，剩余茯苓及其余远志等七味加水煎煮2次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏，加入人参、茯苓细粉与溶化的龟甲胶，充分混匀，干燥，粉成细粉，过筛，装入胶囊，制成1000粒，即得。
6、虽然是十味中药组成的处方，但其质量标准，益脑胶囊只有薄层鉴别，无定量测定；就连中国药典2020年版检测项目最多的同方同工艺的益脑片，也仅有3味药材的薄层鉴别和五味子醇甲的梯度高效液相定量测定，而且其检测的运行时间要花费1小时。目前的质量标准，很难控制制剂的内在质量。
7、为高质量地确保益脑胶囊治疗效果，严格监控水提取工艺，拟对胶囊中的五味子与灵芝的有效成分五味子醇甲和灵芝酸a进行了同时定量研究。
8、查阅文献，灵芝酸a、五味子醇甲为两类化学结构与性质完全不同的两种有效成分，结构式如下：
9、
10、由上述的结构式得知，灵芝酸a的水溶性大，且相互干扰的成分多，所以就出现了即便是单一的灵芝酸a测定，也要采用运行60分钟的梯度洗脱(见图1)；而五味子醇甲的脂溶性要大的多，其质量标准的定量测定也是采用梯度洗脱测定，运行时间55分钟，不论哪种，其分离度都不是太理想。因极性的差异，很难在短的保留时间内，使二者在同一色谱图中呈现，所以到目前为止，还未查阅到益脑胶囊中灵芝酸a和五味子醇甲同时测定的报道。
技术实现思路
1、本发明正是在上述背景的前提下，为提高检测效率，降低检测成本，减少环境污染，首次以简便、快捷的前处理方法得到供试品溶液，采用普通的色谱仪、等度洗脱方式，以体积比为28∶20∶52的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，在255±1nm处，同时测定了样品中的灵芝酸a和五味子醇甲含量，波峰分离良好，进样一针，40分钟出峰完毕。以普通的等度洗脱不但取代了灵芝酸a一种成分测定的梯度洗脱，而且还同时测定了五味子醇甲含量，实现了一测双评,高效、低耗、易普及推广的宗旨。灵芝酸a和五味子醇甲同时测定为首次报道，彰显了技术的新颖性、创造性和低成本、事半功倍双指标检测的实用性。
2、通过方法学考察，灵芝酸a进样量在56.02～560.20ng、五味子醇甲进样量在39.64～396.40ng，与峰面积呈良好的线性关系(见表1、表2、图2、图3)，回归方程分别为：灵芝酸a的y＝861.22x-3629.4，r＝0.99999；五味子醇甲的y＝1729.5x-6806.8，r＝0.99999。采用加样回收实验，结果表明：灵芝酸a6次测定的平均回收率为96.66％,rsd为1.31％(见表3)；五味子醇甲6次测定的平均回收率为99.68％,rsd为1.55％(见表4)。精密度(见表5)、稳定性(见表6)、重复性(见表7)、测定成分的紫外光谱图(见图4、5)、专属性(见图6、7、8、9)、3批样品测定(见表8)、提取溶剂选择(见表9)、超声时间考察(见表10)，实验方法数据均符合方法学要求。简便、准确、高效，可用于益脑胶囊中灵芝酸a和五味子醇甲的同时定量测定。
3、本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
4、(1)a.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为28∶20∶52的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长:255±1nm；柱温为30℃；理论板数按灵芝酸a峰计算不低于5000；
5、b.对照品溶液的制备精密称取灵芝酸a、五味子醇甲对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml各含25μg的混合溶液，摇匀，即得；
6、c.供试品溶液的制备取益脑胶囊20粒，倾出内容物，研细，称取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入加90％甲醇25ml，密塞，称定重量，在功率300w、频率40khz的条件下，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用90％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
7、d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算2种成分的含量。
8、本发明的原理如下：
9、依据相似相溶的提取原理，结合水煎煮的提取工艺，水溶性大的灵芝酸a提取量高，而脂溶性大的五味子醇甲提取量低的实际情况，利用灵芝酸a和五味子醇甲在255nm都呈现吸收峰(见图3、4)，作为检测波长，不但使两成分波峰的大小、面积适合，而且在该检测波长下，大幅度降低了干扰波峰，呈现了液相图谱基线平稳，波峰分离良好，为二成分的同时测定奠定了基础。再依据该二种成分的进样量在一定范围内，分别与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。
10、本发明的创新点及有益效果如下：
11、(1)采用普通的等度洗脱，以体积比为28∶20∶52的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；在255±1nm处，同时测定了样品中灵芝酸a和五味子醇甲的含量，使二种性质与结构完全不同的中药有效成分，能够采用同一流动相，由一次定量测定完成。二成分的定量色谱图，基线平稳，波峰分离良好，灵芝酸a的波峰保留时间约22分钟，五味子醇甲的波峰保留时间约33分钟。方法无萃取、无浓缩、无蒸发，简便、快捷、准确、重现，易于普及掌握，有效提高了检测效率，降低了检测成本，减少了环境污染。
12、(2)查阅文献得知，灵芝酸a和五味子醇甲的测定目前都是单一成分的分别测定，而且多是梯度洗脱，运行一针灵芝酸a要花费60分钟(图1)，五味子醇甲要花费55分钟；不但分离度不理想，重现性也差。采用高效液相法，以等度洗脱，同时测定灵芝酸a和五味子醇甲含量的方法为首次报道。检测效率大幅度提升，仪器成本显著降低，以普通的液相色谱仪，取代了必须具备梯度洗脱的高尖端仪器。不仅如此，更关键的是将一测一评，提升为一测双评，实现了事半功倍。其新颖性、创新性、节约资源、提高检测相率与检测指标的实用价值，有目共睹。
13、(3)本发明方法的问世，不单单为益脑胶囊中的灵芝酸a和五味子醇甲同时检测提供了方法，而且还为二成分在其他复方制剂中的同时测定提供了参考依据与研究思路，具表帅与示范作用。
14、(4)本发明的关键技术是借助了3种流动相中的甲醇具有延缓各类化学成分波峰保留时间，而乙腈具有前提各类化学成分波峰保留时间的特性，配以磷酸溶液能使酸性成分都以分子体存在，消除离子体拖尾的性能，通过无限次甲醇、乙腈和多浓度磷酸间的优选配比研究，探讨到用等度洗脱能使两种极性相差较大的化学成分，在同一流动相中呈现，而且波峰保留时间适宜，灵芝酸a保留时间22分钟，五味子醇甲的保留时间33分钟，基线平稳，重现性好。其运行时间还比单一成分的梯度洗脱缩短20分钟。
1.一种益脑胶囊的一测双评等度洗脱hplc定量测定方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种益脑胶囊的一测双评等度洗脱hplc定量测定方法，其特征在于：所述的一测双评，系指一次测定，同时评价灵芝酸a、五味子醇甲两种成分含量。
