本发明涉及基因表达与调控，尤其涉及一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法。
背景技术：
1、牛羊胚胎附植和胎盘发育异常导致的妊娠损失高达20％，同时也是体细胞克隆胚胎死亡的主要因素；牛羊正常胚胎和克隆胚胎妊娠损失主要发生在胚胎附植时期，研究表明滋养层细胞分化异常是导致妊娠损失的主要因素。
2、目前，牛羊滋养型细胞分化的细胞分子机制尚不清楚，ervs的env基因进化形成的合胞素基因是调控哺乳动物胎盘滋养层细胞分化和胎盘形态多样性的关键基因，因此，只有鉴定出牛羊关键合胞素基因，并揭示其调控胎盘滋养层细胞分化的机制，才能解决正常胚胎和体细胞克隆胚胎附植期妊娠损失率较高的问题。
3、因此，提出一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，分析牛羊基因组中的env基因，并利用bulk转录组测序分析了正常和克隆动物胎盘之间表达差异，筛选到候选合胞素基因，同时通过结构与表达分析候选合胞素基因，并通过细胞融合与假型病毒试验鉴定牛羊合胞素基因典型功能特征，本方案为首次在牛羊基因组中发现牛羊关键合胞素基因，揭示牛羊合胞素基因介导胎盘促融合功能，并验证牛羊合胞素基因所结合的受体为asct1与asct2，为解决妊娠失败和体细胞克隆效率低的问题提供新的理论依据等优点，解决了牛羊正常胚胎和体细胞克隆胚胎附植期妊娠损失率较高的问题。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，包括以下步骤：
4、步骤一：生物信息学鉴定：通过牛羊参考基因组数据及牛羊组织与胚胎转录组测序数据，鉴定出牛羊关键合胞素基因；
5、步骤二：反转录pcr：收集牛羊胎盘，并对胎盘样品进行处理后进行20μl反转录pcr；
6、步骤三：pcr扩增：将反转录得到的cdna作为模板，使用基因扩增仪进行pcr实验；
7、步骤四：荧光定量pcr，反转录得到的cdna用于模板，使用通用型高灵敏度染料法定量pcr检测试剂盒与steponeplus进行荧光定量检测sus1与sus2表达量；
8、步骤五：细胞系构建：将gasct1/2与basct1/2的cds序列插入到ppb-puro-ef1aegfp质粒(addgene)，复苏并培养hek293t细胞，共同转染ppb-puro-ef1aegfp-gasct1/2或ppb-puro-ef1aegfp-basct1/2与prp-caghypbase质粒，得到细胞系；
9、步骤六：细胞融合试验：通过细胞融合与假型病毒试验鉴定牛羊合胞素基因典型功能特征。
10、优选地，所述生物信息学鉴定的具体步骤为：
11、在ncbi的genome数据库中下载gcf_002263795.3(ars-ucd2.0)与gcf_001704415.2(ars1.2)牛羊参考基因组fasta文件，利用tblastnv2.5.0将参考基因组fatsa文件建立核苷酸数据库，ncbi蛋白库中accensionnumber为np_041188.1、yp_004222726.1、np_045939.1、np_056899.1、np_054717.1、np_040334.1、np_057856.1、np_056883.1、np_043923.1作为tblastn程序中的query，参数默认；
12、在ncbi的geo数据库收集牛羊组织与胚胎转录组测序数据，使用fastq-dumpv2.9.6将sra对象转换为fastq文件，利用hisat2v2.2.1将gcf_002263795.3(ars-ucd2.0)与gcf_001704415.2(ars1.2)牛羊参考基因组建立基因组索引，然后将fastq文件比对至参考基因组得到原始bam文件，并通过samtoolsv1.17将bam文件排序从而进行下一步tpm与counts值计算；
13、将第一次tblastn得到的hits通过氨基酸大于或等于100aa且无提前终止密码子进行迭代tblastn，将迭代tblastn得到的hits通过氨基酸大于或等于200aa且无提前终止密码子后分别得到3285和2789条hits；
14、将去冗余后得到所有hits根据染色体号以及起始终止位置与方向制作成基因组注释文件，并加入至gcf_002263795.3(ars-ucd2.0)与gcf_001704415.2(ars1.2)参考基因组注释文件并重新排序用于转录组数据计算与分析；
15、使用stringtie2v2.2.1计算以上去冗余后所有hits的tpm与counts，设置参数“-rf”明确规定(1)中bam文件的转录本组装的链特异性，将得到的gtf文件通过stringtie2中“-merge”参数合并从而得到一个合并后的gtf文件，使用stringtie2的“-e-rf”参数计算收集的组织与胚胎的样品的tpm与counts，发现牛羊所有去冗余后hits中各有13条与11条hits与合并后得到的组装转录本重叠，因此将其命名为b1-b13与g1-g11，并且发现b3、b4、b5、b9、b11、b13、g1、g2、g5、g8与g11在正常与克隆成熟胎盘中差异表达，且在胚胎中无表达；
16、使用ncbi的conserveddomian数据库发现b3、b4、b5、b9、b11、b13、g1、g2、g5、g8与g11都具有保守结构域tlvcoatsuperfamily和ebola_hiv-1-like_hr1-hr2superfamily，且都具cxxc与rxxr基序。
17、优选地，所述反转录pcr的具体步骤为：
18、从屠宰场与克隆牛羊基地收集的胎盘放入含1×青链霉素生理盐水的保温瓶，水温约20℃，4h内运抵实验室；
19、剪去卵巢外多余的组织，用生理盐水反复洗涤干净；
20、胎盘样品用无rnase的洗卵用pbs洗三次，每次3min，使用剪刀剪取黄豆大小组织至研钵同时加入液氮研磨；
21、加入1ml预冷的trizol试剂，室温裂解10min；加200μl氯仿，震荡30s，静置3min；4℃条件下12,000rpm离心15min；吸取上层水相，并与等体积的异丙醇混合，静置30min；4℃条件下12,000rpm离心10min；以1ml75％乙醇溶液洗涤沉于管底的rna小块；4℃条件下8,000rpm离心5min；重复洗涤一次后，室温晾干5–10min；以适量无rnase的ddh2o溶解rna，最后测量rna的浓度和od值；
22、20μl反转录pcr体系：10×rtbuffer2μl、dntpmix4μl、randomdecamers1μl、oligo(dt)primers1μl、反转录酶m-mlvrt1μl、胚胎裂解产物10μl、rnase抑制剂1μl；
23、反应程序为42℃，30min；95℃，10min；降温至4℃，cdna产物–80℃保存或直接进行荧光定量pcr。
24、优选地，所述pcr扩增的具体步骤为：
25、将8个牛羊胎盘特异候选合胞素基因的扩增引物序列进行合成，将反转录得到的cdna作为模板，使用基因扩增仪qiqian-a100进行pcr实验；
26、采用hsdnapolymerase试剂盒进行高保真pcr试验；
27、反应体系(50μl)：5×primestarbuffer(mg2+plus)10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、上下游引物(10-15pmol)各1μl、template1μl、primestarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl、ddh2o32.5μl；
28、反应参数：98℃，2min预变性；98℃，20s变性，58-65℃，34s退火，72℃延伸2min30s，40个循环；72℃延伸5min。
29、优选地，所述荧光定量pcr的具体步骤为：
30、将8个牛羊胎盘特异候选合胞素基因定量引物序列送至合成；
31、反转录得到的cdna用于模板，使用通用型高灵敏度染料法定量pcr检测试剂盒与steponeplus进行荧光定量检测sus1与sus2表达量；
32、反应体系(10μl)：2×chamquniversalsybrqpcrmastermix5μl、上下游引物(10-15pmol)各0.2μl、template1μl、ddh2o4.6μl；
33、反应参数为：95℃，30s预变性；95℃，10s变性，60℃，30s退火，根据仪器默认熔解曲线采集程序；
34、内参引物为牛羊组蛋白h2a基因。
35、优选地，所述细胞系构建的具体步骤为：
36、将gasct1/2与basct1/2真核载体克隆引物序列送至合成；
37、将gasct1/2与basct1/2的cds序列插入到ppb-puro-ef1aegfp质粒(addgene)，使用peasy-uni无缝克隆和组装试剂盒进行操作；
38、hek293t细胞由本实验室保存，复苏后加入事先配好的培养液(gibco胎牛血清9％+双抗1％+gibcodf12培养基90％)进行培养，等待细胞慢慢迁移出来，长满后传代到6孔板，进行后续实验；
39、共同转染ppb-puro-ef1aegfp-gasct1/2或ppb-puro-ef1aegfp-basct1/2与prp-caghypbase质粒，24-48h后加入5ng/ml嘌呤霉素筛选，每天更换培养基，10-15天后即得到细胞系；
40、取适量细胞进行免疫荧光以及蛋白印迹检测所得细胞系。
41、优选地，所述细胞融合试验的具体步骤为：
42、8个牛羊胎盘特异候选合胞素基因的cds序列被插入到pcdna3.1-3xflag-c质粒，使用peasy-uni无缝克隆和组装试剂盒进行操作；
43、对于lacz报告质粒，表达带有脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点的lacz，在存在t7聚合酶的情况下(pcdna3.1-t7-emcv-lacz)，移除pcdna3.1(+)的cmv启动子和增强子序列作为骨架质粒，插入emcv、ires、lacz和t7终止子序列，同样使用peasy-uni无缝克隆和组装试剂盒进行操作；
44、emcv序列通过pcr扩增与ires序列连接；
45、ires和lacz序列分别从pmx-ires-puro和pub6-v5-his-lacz中克隆；
46、t7终止子序列进行合成；
47、上述所有pcr均使用primestarhsdna聚合酶进行；
48、gasct1/2与basct1/2过表达hek293t细胞使用pei试剂转染法，即细胞以2×105的密度传入24孔板或1×106的密度传入6孔板12h后，加入转染预混液，转染4-6h后再将分别转染后的细胞共孵育。
49、优选地，所述转染预混液的配制：
50、准备两个ep管，加入300微升opti-mem，两个管分别预混2μg质粒(1μgpcdna3.1-3xflag-c-将8个牛羊胎盘特异候选合胞素基因和1μgpcdna3.1-t7-emcv-lacz)和10μlpei试剂以及2μgpcag-t7-pol，分别室温静置5min；轻柔混匀并再次静置15min后转染预混液加入6孔板一孔；
51、待培养24-48h后，弃去培养基，使用pbs将细胞洗5遍，使用4％多聚甲醛固定细胞20min后pbs洗5遍，加入预热的xgal染色液置于37摄氏度培养箱孵育24h后显微镜下观察。
52、本发明与现有技术相比，其有益效果为：
53、1、该牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，通过分析牛羊基因组中的env基因，并利用bulk转录组测序分析了正常和克隆动物胎盘之间表达差异，筛选到候选合胞素基因，同时通过结构与表达分析候选合胞素基因，并通过细胞融合与假型病毒试验鉴定牛羊合胞素基因典型功能特征，本方案为首次在牛羊基因组中发现牛羊关键合胞素基因，揭示牛羊合胞素基因介导胎盘促融合功能，并验证牛羊合胞素基因所结合的受体为asct1与asct2，为解决妊娠失败和体细胞克隆效率低的问题提供新的理论依据。
54、2、该牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，共筛选到8个候选合胞素基因，通过结构分析发现8个候选合胞素基因结构保守，表达分析发现8个候选合胞素基因在胎盘特异高表达，揭示sus1与sus2可能介导牛羊胚胎发育并发挥重要作用，通过细胞融合与假型病毒试验验证发现，sus1与sus2均可促进细胞融合并且介导病毒进入，这进一步表明将8个牛羊胎盘特异候选合胞素基因可能参与早期胚胎发育与胎盘形成过程。
1.一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述生物信息学鉴定的具体步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述反转录pcr的具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述pcr扩增的具体步骤为：
5.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述荧光定量pcr的具体步骤为：
6.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述细胞系构建的具体步骤为：
7.根据权利要求1所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述细胞融合试验的具体步骤为：
8.根据权利要求7所述的一种牛羊胚胎附植关键基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述转染预混液的配制：
