本发明涉及电化学生物传感领域，尤其是涉及一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法。
背景技术：
1、5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)是5-甲基胞嘧啶(5mc)的羟甲基化形式，最早于1952年在噬菌体中被发现。2009年，两组独立的研究团队证实了5hmc在小鼠脑细胞和干细胞中存在的事实，从而引发了科学界对5hmc的广泛关注和研究。研究发现，5mc向5hmc的转化是由10-11易位(ten-eleven translocation，tet)家族蛋白在fe2+和酮戊二酸共同存在的情况下催化而成。进一步研究表明，特定位点的5hmc不仅与细胞分化密切相关，还与多种实体肿瘤的发生和发展有关。此外，对特定基因片段5hmc的研究为本技术提供了深入了解基因表达机制的新视角。现已发现，5hmc在骨髓增生异常综合症、亨廷顿病和老年痴呆症等疾病中表现出显著变化，而5hmc含量的减少已被视为癌症诊断和治疗的重要标志特征。
2、目前，5hmc的检测方法根据基因组分辨率的不同可分为三类。第一类方法包括薄层色谱、高效液相色谱和液相色谱-质谱联用，这些方法能够检测整个基因组中5hmc的总体水平，但只能反映大规模的5hmc变化。第二类方法基于dna免疫沉淀技术，利用5hmc特异性抗体或修饰后5hmc的抗体来测量特定位点的5hmc富集情况，但这些方法无法定量单个cpg位点的5hmc含量，因此无法用于研究环境因素对特定cpg位点5hmc的影响。第三类方法是单碱基分辨率检测技术，能够定量基因组中单个cpg位点的5hmc，从而提供更多的生物学信息。例如，这些不同羟甲基化的cpg位点可以被注释到基因上，为后续的通路分析和机制研究提供重要信息。
3、目前，广泛使用的单碱基水平5hmc测量方法是亚硫酸氢盐测序及其衍生方法，包括tet辅助亚硫酸氢盐测序和氧化+亚硫酸氢盐测序。尽管这些基于测序的方法性能优良，但其操作复杂、耗时较长(通常至少需要两周时间)。因此，迫切需要一种简单、省时且高效的检测手段来对特定基因的特定位点5-羟甲基化胞嘧啶进行检测。
技术实现思路
1、现有技术中存在的5-羟甲基化胞嘧啶检测方法操作复杂、耗时较长且一般不能针对特定位点，就这些检测方法的不足，本技术提供一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，该方法简单、快速且灵敏度高。
2、本发明提供的方法基于体外构建的含有未甲基化、甲基化和羟甲基化dna的双链dna模型，首先通过cpg甲基转移酶处理双链dna模型，实现了对羟甲基化dna与其它两种碱基类型dna(甲基化dna和未甲基化dna)的区分；之后通过亚硫酸盐处理和氧化+亚硫酸盐处理、半标记引物特异性扩增以及双链dna杂交，得到双标记双链dna并被捕获为电流信号；最后，通过t7核酸内切酶i识别并切割由5-羟甲基化胞嘧啶导致的a-c错配，观察到电流信号的下降即表明样品中5-羟甲基化胞嘧啶的存在。该方法能够实时检测双链dna中的5-羟甲基化胞嘧啶含量，具有高灵敏度和精确度，以及单碱基分辨率，并且在100000倍过量的甲基化或未甲基化dna存在下，仍能检测到10pg的羟甲基化dna。
3、为了实现上述目标，本发明提供了以下技术方案：
4、本发明的技术方案提供一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步骤：
5、s1准备好待测的双链dna样品，将双链dna使用cpg甲基转移酶处理；
6、s2将s1经过处理后的双链dna等分为两部分，分别记为dna-a和dna-b；其中，将dna-a使用亚硫酸氢盐处理；将dna-b先使用氧化剂氧化后，再使用亚硫酸氢盐处理；
7、s3设计半标记引物，对s2处理后得到的dna-a使用生物素标记过的引物进行特异性扩增，对s2处理后得到的dna-b使用地高辛标记过的引物进行特异性扩增；
8、s4将s3得到的两种不同标记后的双链dna进行dna杂交，获得杂交双链dna；
9、s5利用电化学生物传感平台检测上述杂交双链dna，其中双标记双链dna可被捕获并产生电流信号；
10、s6使用碱基错配识别切割酶识别并切割由5hmc导致的a-c错配，如果电流信号相较于步骤s5中的电流信号降低，说明待测dna中含有5-羟甲基化胞嘧啶；如果电流信号未有降低，说明待测dna中不含5-羟甲基化胞嘧啶。
11、进一步的，s1所述的双链dna样品来自待测细胞，通过对待测细胞的dna进行提取、扩增后得到，所得双链dna通过cpg甲基转移酶处理以区分羟甲基化的dna与非羟甲基化dna；
12、更进一步的，所述dna提取和扩增按照本领域常规操作来进行，扩增时所需引物根据待测细胞来设计，模板为待测片段的dna序列；所述cpg甲基转移酶处理使用试剂盒，按照试剂盒中说明书所指示的步骤进行，处理后，c转化为5mc，而5mc和5hmc保持不变。
13、更进一步的，步骤s1在cpg甲基转移酶处理之后，需要对dna进行纯化，以除去其中杂质，所述杂质包括cpg甲基转移酶、甲基转移酶反应液、s-腺苷蛋氨酸(s-adenosylmethionine，sam)；所述纯化操作为本领域常规操作，一般来说使用纯化试剂盒来纯化，并根据试剂盒所示步骤进行；纯化过程中需彻底去除酒精，去除酒精的方法是室温下挥发时间大于1h，目的是消除酒精对后续氧化处理步骤的影响。
14、进一步的，步骤s2中等分后将1μg dna-a和1μg dna-b分别放在1.5ml的ep管中，保证总质量一致。
15、进一步的，步骤s2所述的氧化剂为kruo4，浓度为0.3～1.2mm，优选为0.9mm；所述氧化剂kruo4与dna-b的比例为2μl：1μg，所述氧化剂分两次添加。
16、进一步的，步骤s2中所述亚硫酸氢盐优选为亚硫酸氢钠；
17、所述亚硫酸氢盐处理步骤，可以使用本领域常用的dna亚硫酸氢盐转化试剂盒，并根据试剂盒所述的步骤进行，或者根据本领域常规的亚硫酸氢盐处理步骤进行；
18、进一步的，步骤s3所述的半标记引物是指分别用生物素和地高辛在dna-a和dna-b的引物的5'端进行标记；所述引物的序列依据待测dna的序列来设计；所述引物构建方法和生物素、地高辛标记，采用本领域技术人员常用的方法；
19、所述特异性扩增的操作按照本领域常用的pcr扩增操作进行，特异性扩增的体系(50μl)为：上游引物:2.5μl(10pmol)，下游引物:2.5μl(10pmol)，high-fidelity 2xmaster mix:25μl，template dna:10ng，miliq:to 50μl；
20、扩增反应条件是98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃退火延伸30s，循环结束后72℃延伸5min，4℃+∞，循环数为30；dna-a和dna-b的模板链序列相同。
21、在上述dna-a的亚硫酸氢盐处理及后续特异性扩增过程中，5mc和5hmc均被读取为c，而含有c的dna链被标记上生物素；
22、在上述dna-b的氧化+亚硫酸氢盐处理及随后的特异性扩增过程中，5mc被读取为c，5hmc先被氧化为5fc，再转化为u并被读取为t，之后，含有c或t的dna链在pcr扩增后被标记上地高辛。
23、进一步的，步骤s4所述的dna杂交为本领域常规操作，得到的杂交双链dna有9种，包括：
24、生物素c-g地高辛、生物素c-a地高辛、生物素c-g、c-g地高辛、c-g、c-a地高辛、t-g、t-g地高辛和t-a地高辛；
25、其中，杂交双链dna中所有生物素c和无任何修饰的g单链来自dna-a，其它单链来自dna-b；特殊地，生物素c-a地高辛是由5hmc引起的错配dna；只有两种双标记的双链dna(生物素c-g地高辛和生物素c-a地高辛)能够被捕获在生物传感电极上，并在加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶(sa-hrp)和tmb(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)后显示电流信号。
26、进一步的，步骤s5所述双标记双链dna包括上述生物素c-g地高辛、生物素c-a地高辛，通过地高辛-地高辛抗体特异性结合在电极上，生物素与辣根过氧化物酶耦联的链霉亲和素相结合，其中辣根过氧化物酶催化tmb(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)产生电流信号。
27、进一步的，步骤s5所述电化学生物传感平台由16通道电化学测试仪和16通道丝网印刷电极阵列构成，其中每个通道由一个三电极体系组成；所述三电极体系包括碳工作电极、碳辅助电极、ag/agcl参比电极。
28、进一步的，步骤s6所述碱基错配识别切割酶可以识别并切割a-c错配；所述碱基错配识别切割酶优选为t7核酸内切酶i、胸腺嘧啶糖基化酶、核酸内切酶v和taq muts，更优选为t7核酸内切酶i；当使用t7核酸内切酶i时，所述切割的反应温度为37～42℃，优选为37℃，反应时间优选4～16小时，mg2+浓度优选1～15mm，更优选为1mm。
29、进一步的，在电化学生物传感平台上进行测量时初始设置具体参数如下(用于定义测量时的重要参数，比如电压范围，扫描速率，扫描次数，采样频率)：初始电压(v)：-0.3，最高电压(v)：0.6，最低电压(v)：-0.3，开始扫描方向：正，扫描速率(v/s)：0.1，扫描次数：2，采样间隔(v)：0.001，静止时间(秒)：2，灵敏度(a/v)：1e-5。
30、然后使用稳态时间电流曲线法来测定电流值，参数设置如下：初始电压(v)：-0.05，时间间隔：0.1，运行时间(秒)：100，静止时间(秒)：3，灵敏度(a/v)：1e-5，最后记录100秒处的电流值。
31、进一步的，s6如果电流信号相较于步骤s5中的电流信号降低，则将该电流信号的变化值记为△current；
32、△current＝593.98ln(x)+6538.8，该公式的r2＝0.9627，式中x＝5hmc/c，即待测样品中5-羟甲基化胞嘧啶5hmc浓度和胞嘧啶c浓度的比值，根据公式和△current可计算得到该比值x，即待测样品中5hmc的相对含量；
33、另外，△current＝609.1ln(y)+7274.8，该公式的r2＝0.9866，式中y＝5hmc/5mc，即待测样品中5-羟甲基化胞嘧啶5hmc浓度和5-甲基化胞嘧啶5mc浓度的比值，根据公式和△current可计算得到该比值y，即待测样品中5hmc的相对含量；
34、最后根据上述两个相对含量x、y和待测样品的总质量，即可计算5-羟甲基化胞嘧啶的含量。
35、与现有技术相比，本发明至少有以下有益效果：
36、(1)本发明的技术方案成功构建出了一种5-羟甲基化胞嘧啶的检测方法，并且使用该方法实现了对脐带间充质干细胞分化过程中5hmc变化的实时定量；
37、(2)本发明提供的方法克服了现有测序方法劳动强度大且耗时长的缺点，为研究5hmc在早期发育和细胞稳态中的作用提供了有力工具，有望能够进一步揭示5hmc在早期发育和细胞稳态中的作用；
38、(3)本发明提供的方法具有高灵敏度，能够在存在10万倍甲基化dna或未甲基化dna的情况下检测到10pg的羟甲基化dna；
39、(4)本发明的检测方法检测周期短，可在24小时内完成，并且具备单碱基分辨率。
1.一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s1所述的双链dna样品来自待测细胞，通过对待测细胞的dna进行提取、扩增后得到；所得双链dna通过cpg甲基转移酶处理以区分羟甲基化的dna与非羟甲基化dna。
3.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s2中所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠；所述氧化剂为kruo4，浓度为0.3～1.2mm；所述氧化剂kruo4与dna-b的比例为2μl：1μg。
4.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s3所述的半标记引物是指分别用生物素和地高辛在dna-a和dna-b的引物的5'端进行标记。
5.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s4所述的杂交双链dna有9种，包括生物素c-g地高辛、生物素c-a地高辛、生物素c-g、c-g地高辛、c-g、c-a地高辛、t-g、t-g地高辛和t-a地高辛；所述生物素c-a地高辛是由5hmc引起的错配dna。
6.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s5所述双标记双链dna包括如权利要求5所述生物素c-g地高辛、生物素c-a地高辛，在电化学生物传感平台中会产生电流信号；所述双标记双链dna上的地高辛与传感器上的地高辛抗体特异性结合，从而捕获双标记双链dna并使之结合在电极上；加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶sa-hrp和3,3'，5,5'-四甲基联苯胺后，双标记双链dna上的生物素与链霉亲和素相结合，与链霉亲和素耦联的辣根过氧化物酶催化3,3'，5,5'-四甲基联苯胺，进而产生电流信号。
7.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s5所述电化学生物传感平台由16通道电化学测试仪和16通道丝网印刷电极阵列构成，其中每个通道由一个三电极体系组成，所述三电极体系包括碳工作电极、碳辅助电极、ag/agcl参比电极。
8.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s5中在电化学生物传感平台上进行测量时具体参数如下：初始电压：-0.3v，最高电压：0.6v，最低电压：-0.3v，开始扫描方向：正，扫描速率：0.1v/s，扫描次数：2，采样间隔：0.001v，静止时间：2秒，灵敏度：1e-5a/v；
9.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，s6所述碱基错配识别切割酶能识别并切割a-c错配；所述碱基错配识别切割酶选自t7核酸内切酶i、胸腺嘧啶糖基化酶、核酸内切酶v和taq muts中的任一种；当使用t7核酸内切酶i时，切割的反应温度为37～42℃，反应时间为4～16小时，mg2+浓度为1～15mm。
10.根据权利要求1所述的一种检测特定位点5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤s6中所述公式为：
