：本发明属于海洋生物和海藻场构建领域，具体地说涉及一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法。
背景技术：
0、技术背景：
1、条斑紫菜是我国重要的经济红藻，在江苏和山东近海广泛栽培，年产值超50亿元，具有重大的经济价值。条斑紫菜生活史由丝状孢子体和叶状配子体进行异形世代交替。此外，条斑紫菜配子体还可以产生单孢子进行无性繁殖。该过程周期很短，不需经过丝状体过程便可再次直接生成叶状体，对条斑紫菜生物量扩增具有重要意义。实验室培养条斑紫菜叶状体主要依赖于无性繁殖过程，以此快速获得叶状体材料。在人工栽培过程中，依赖于单孢子的无性繁殖也是紫菜生物量快速大量扩增的重要途径。单孢子释放出来后需要附着在基质上才能发育，因此促进条斑紫菜叶状体大量释放单孢子并促进其附着对其生物量快速大量获取具有十分重要的意义。
2、海藻场是海洋牧场的重要组成部分，但近年来海藻场面临逐渐退化，规模逐渐缩小的困境。通过构建人工藻礁实现海藻场的人工营造是构建海洋牧场的重要手段。紫菜藻礁的构建目前尚未见有报道，主要原因可能是紫菜生物量扩增和藻体在藻礁上的附着存在困难。因此，开发促进紫菜单孢子释放和提升单孢子附着力的方法是构建紫菜藻礁的有效手段。
3、本发明提供了一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法。该方法以实验室培养海水菌的废液为原料，添加到条斑紫菜正常培养基中，可以显著促进条斑紫菜单孢子释放，并促进单孢子在基质上的附着，达到快速大量生成生物量的目的。该方法可以应用于实验室内条斑紫菜培养，快速大量获得实验用材料。还可以应用于人工藻礁构建中，通过添加该废液到建礁材料中，促进条斑紫菜生物量快速大量扩繁，在人工藻礁构建和海藻场营造方面具有广泛的应用场景。
技术实现思路
0、
技术实现要素：
1、本发明的目的在于提供一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法。通过分离获得海水菌sulfitobactersp.或者tenacibaculumsp.，用2216e液体培养基培养后收集上清液，加入到条斑紫菜叶状体培养基中。结果表明该方法可以大量促进条斑紫菜单孢子释放和附着，在条斑紫菜生物量快速大量增殖和海藻场人工藻礁构建方面具有广阔的应用前景。
2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
3、一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其具体步骤如下：
4、1、采集条斑紫菜叶状体藻体，在实验室内用干净海水清洗3-5遍，除去表面附着杂藻。用镊子和毛刷除去不易清洗掉的杂质，得到干净的条斑紫菜叶状体，培养于无菌海水中，添加pes作为培养基。
5、2、取干净的条斑紫菜叶片，切取适量叶片放于1.5ml ep管中，加入无菌pes海水培养基1ml,在振荡器上震荡1-2min。吸取1μl震荡后的培养基，加入到1ml新的无菌pes培养基中，震荡混合均匀。取20ul稀释后的培养基涂布于2216e固体培养基上。放于28恒温培养箱中，培养12h至大小合适的单菌落出现。
6、3、挑取单菌落至2216e液体培养基中，放入28℃摇床中培养10h至培养基浑浊。
7、4、用引物对挑取的菌落进行16s rdna序列扩增并进行sanger测序，并在ncbi上进行比对。获得目的菌株sulfitobactersp.或者tenacibaculum sp.。
8、所用引物对为：
9、27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'
10、1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'
11、5、对获得的目的菌株进行扩大培养，接种至2216e液体培养基中，在28℃摇床中培养10h至培养基浑浊。
12、6、对5中浑浊的培养基进行10000g离心10min，获取上清废液。
13、7、取100μl的6中所的废液，加至30ml的无菌pes海水培养基中，在细胞培养瓶中培养条斑紫菜叶状体。
14、8、把上述条斑紫菜放于15℃恒温培养箱中，设定光照条件为1000-2000lux。
15、连续培养2-4周。每周更换新的pes培养基，并加入上述比例的海水菌培养废液。显微镜下观察即可看到大量单孢子释放，并附着在基质上。
16、所用的海水菌单克隆菌株为sulfitobactersp.或者tenacibaculum sp.中的一种或两种。
17、步骤无菌海水完全浸没条斑紫菜叶状体。
18、步骤(2)中的无菌海水培养基为pes培养基，培养条件为：温度15-20℃，光照1000-2000lux，光周期12/12-14/10。
19、步骤(3)用无菌海水稀释，稀释至原体积的8000-10000倍，分离的菌株需要经过2216e液体培养基进行扩大培养，培养温度为28-29℃，培养时间为12-24h，获得单菌落。
20、用于获得海水菌培养废液的海水菌sulfitobactersp.或者tenacibaculum sp.由条斑紫菜叶状体表面附着的菌中分离所得。
21、步骤(4)中的获得的上清液需要按1:600-800比例加入到条斑紫菜叶状体pes培养基中；培养时间为1-4周(优选2-4周)，所需温度为15℃，所需光照为1000lux，光周期为12/12。
22、以下对发明的部分进行说明：
23、所述菌株sulfitobactersp.或者tenacibaculum sp.为条斑紫菜叶状体上分离所得。且分离所得的菌中具有促进条斑紫菜单孢子释放和附着效果的不仅仅是以上两种菌，其它分离的菌株也可能有同样的效果。
24、所述海水菌培养基废液可以进行高温高压灭菌处理，不影响其添加效果。
25、所述离心所得上清废液具有促进单孢子大量释放的效果，但仅单独向条斑紫菜培养基中加入沉淀中的活体菌并无促进单孢子大量释放的效果。
26、所述加入的上清废液体积并非固定值，50-200ul，或者更宽范围的体积加入到30ml的条斑紫菜培养基中均有促进单孢子大量释放的效果，也就是说海水菌培养废液的浓度范围较为宽泛，0.15％-0.66％的浓度均由促进效果。
27、所述条斑紫菜培养条件为：温度：15-18℃，光照强度：150-200lux，培养基：pes培养基。每周更换新的培养基，并加入对应比例的海水菌培养废液。
28、相对现有技术，本发明的有益技术效果为：
29、1.本发明所用材料为海水菌培养废液，具有废物再利用的效果，且效果显著。
30、2.本发明方法可以显著性大量促进条斑紫菜单孢子释放和附着，可以快速大量获得条斑紫菜生物质。在实验室内培养、野外人工栽培以及人工藻礁构建、海藻场营造方面具有广阔的应用前景。
1.一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：
2.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：所用的海水菌单克隆菌株为sulfitobactersp.或者tenacibaculum sp.中的一种或两种。
3.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：步骤(1)无菌海水完全浸没条斑紫菜叶状体。
4.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：步骤(2)中的无菌海水培养基为pes培养基，培养条件为：温度15-20℃，光照1000-2000lux，光周期12/12-14/10。
5.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：步骤(2)中震荡时间是1-2min。
6.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：步骤(3)用无菌海水稀释，稀释至原体积的8000-10000倍，分离的菌株需要经过2216e液体培养基进行扩大培养，培养温度为28-29℃，培养时间为12-24h，获得单菌落。
7.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：用于获得海水菌培养废液的海水菌sulfitobactersp.或者tenacibaculumsp.由条斑紫菜叶状体表面附着的菌中分离所得。
8.按权利要求1所述的一种利用海水菌培养废液促进条斑紫菜快速生殖和附着的方法，其特征在于：步骤(4)中的获得的上清液需要按1:600-800比例加入到条斑紫菜叶状体pes培养基中；培养时间为2-4周，所需温度为15℃，所需光照为1000lux，光周期为12/12。
