本发明属于有机污染物检测领域，具体涉及一种红树植物中27种类固醇激素及其代谢产物的快速检测方法。
背景技术：
1、类固醇激素是胆固醇在不同组织(包括大脑、肾上腺、性腺等)中经过合成代谢产生的衍生物。类固醇激素及其代谢产物可通过污水处理厂、畜禽和水产养殖场、制药厂以及医院等多种排放途径进入淡水环境甚至海洋环境。尽管类固醇激素及其代谢产物在水环境中检测到的浓度几乎总是在几纳克/升到几微克/升之间，但这些污染物具有较强的内分泌干扰效应和生物蓄积性，因此长期接触可达到有害浓度，如影响生物体内的正常代谢功能，干扰生物体的正常生长、发育和生殖等功能，甚至产生致死、致癌和致畸形等。
2、随着对环境介质中不断发现的类固醇激素及其代谢产物的了解加深，以及对其生态危害认识的提升，研究人员已经广泛开展了关于这些物质在动物体内积累和产生生物效应的研究。红树林湿地通过其土壤—植物—微生物复合系统过滤和转化污染物、捕获沉积物等作用来净化随陆地各种径流入海的被污染的海水。而目前关于类固醇激素在红树植物体内迁移转化的研究仍存在诸多困难，如类固醇激素在红树植物中浓度痕量、红树植物中存在的高色素含量对定量分析的干扰、提取和分析方法单一等。大多数分析方法仅限于某一类激素的分析，因此，建立不同红树植物组织多种类固醇激素的一体化分析方法，对于了解红树植物中类固醇激素的污染状况，积极防控类固醇激素的近海污染，保护近海水生生态系统安全具有重要意义。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种红树植物中27种类固醇激素及其代谢产物的快速检测方法，所述检测方法对前处理以及净化等操作进行优化，使其可适用于不同种类红树植物及其不同组织的检测，方法兼容性强，检测精度高。
2、本发明采用的具体方案为：
3、一种红树植物中27种类固醇激素的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
4、s1.取冷冻干燥研磨过筛后的红树植物样品于离心管a中，然后加入同位素内标平衡；加入乙腈，涡旋，超声萃取，离心，取上清液；
5、s2.再先后加入甲醇和乙腈，涡旋，超声萃取和离心，合并s1的乙腈萃取后、s2甲醇萃取后和乙腈萃取后的上清液；
6、s3.将上清液移至含有填料的离心管b中，涡旋离心，取上清液置于玻璃试管中；
7、s4.用乙腈再次提取s3中的填料，涡旋离心，合并两次上清液于玻璃试管中；
8、s5.将玻璃试管中的溶液氮吹浓缩后定容于甲醇中；
9、s6.用高效液相色谱-串联质谱对类固醇激素及其代谢产物进行测定，通过数据分析和定量计算，得到植物中类固醇激素及其代谢产物的含量水平；
10、所述的27种类固醇激素是4-androstene-3,17-dione、testosterone、17β-boldenone、17α-trenbolone、17β-trenbolone、19-nortestosterone、stanozolol、17α-methyltestosterone、cortisol、tetrahydrocortisol、11-deoxycorticosterone、prednisolone、progesterone、20α-dihydroprogester one、17α,20α-dihydroxyprogesterone、17α,20β-dihydroxyprogesterone、17α-hydroxyprogesterone、17α-hydroxyprogesterone acetate、11-ketoprogesterone、1-dehydroprogesterone、16-dehy droprogesterone、medroxyprogesterone acetate、norvinisterone、dydrogesterone、cyproterone acetate、megestrol acetate、norethindrone。
11、所述的27种类固醇激素及其分析的液相色谱-串联质谱参数如下：
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15、优选地，步骤s6中所述高效液相色谱-串联质谱的测试条件为：所用液相色谱流动相为a相：含5mm乙酸铵和体积分数0.05％甲酸的超纯水和b相：甲醇，流速为0.2ml/min，色谱柱温度为40℃，梯度洗脱程序开始8min为60％甲醇，12min内降至50％甲醇，后运行时间设定为3min，用于下一次进样前的色谱柱平衡，使用eclipseplusc18(2.1mm×50mm，1.8μm)反相色谱柱分离目标化合物，离子源为ajs esi正模式，离子源中氮气温度为350℃，气体流速为3l/min，雾化器压力50psi；鞘气温度为350℃，流速为12l/min；毛细管电压为3500v。
16、优选地，所述的步骤s1中，红树植物样品与乙腈的比例为(0.1～0.2)g：2ml；
17、优选地，所述的同位素内标是p-d9、crl-d2、t-d3。进一步优选，平衡时间为10～30min。
18、优选地，所述的填料为c18、gcb和无水mgso4，填料质量之比为(0.15～0.2):(0.15～0.2):(0.5～0.6)g，进一步优选质量比为3:3:10的c18、gcb和无水mgso4。
19、优选地，所述的s5的将玻璃试管中的溶液氮吹浓缩后定容于甲醇中，再用0.22微米有机相滤头过滤到棕色进样小瓶中。
20、优选地，步骤s1和s2中超声时间10min，离心转速为3500rpm，时间为10min。
21、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
22、1.本发明简化了样品前处理步骤，相较于传统的固相萃取方法，本方法省去了固相萃取中富集小柱所需的活化、淋洗、洗脱等繁琐步骤，大大减少了有机溶剂使用量和前处理时间，同时降低成本，有利于大批量处理样品。
23、2.传统的方法多针对某一类激素进行处理，本发明可用于多类激素同时处理，显著提高了样品的分析效率。相比于其他方法，能更好的反应27种类固醇激素在红树植物组织中的浓度，保证出峰稳定无杂峰，而且也能很好分离。能为进一步开展类固醇激素的生态风险评估以及在红树植物中污染状况的研究提供有效的方法手段。
24、3.本方法可用于不同种类红树植物以及不同植物组织的样品检测，方法兼容性强，不需要针对某种特定的植物及组织有其特定的方法。能够有效去除叶和茎的叶绿素。
1.一种红树植物中27种类固醇激素的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的27种类固醇激素及其分析的液相色谱-串联质谱参数如下：
3.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤s6中所述高效液相色谱-串联质谱的测试条件为：所用液相色谱流动相为a相：含5mm乙酸铵和体积分数0.05％甲酸的超纯水和b相：甲醇，流速为0.2ml/min，色谱柱温度为40℃，梯度洗脱程序开始8min为60％甲醇，12min内降至50％甲醇，后运行时间设定为3min，用于下一次进样前的色谱柱平衡，使用eclipseplusc18(2.1mm×50mm，1.8μm)反相色谱柱分离目标化合物，离子源为ajs esi正模式，离子源中氮气温度为350℃，气体流速为3l/min，雾化器压力50psi；鞘气温度为350℃，流速为12l/min；毛细管电压为3500v。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤s1中，红树植物样品与乙腈的比例为(0.1～0.2)g：2ml。
5.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的同位素内标是p-d9、crl-d2、t-d3。进一步优选，平衡时间为10～30min。
6.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的填料为c18、gcb和无水mgso4，填料质量之比为(0.15～0.2):(0.15～0.2):(0.5～0.6)g，进一步优选质量比为3:3:10的c18、gcb和无水mgso4。
7.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述的s5的将玻璃试管中的溶液氮吹浓缩后定容于甲醇中，再用0.22微米有机相滤头过滤到棕色进样小瓶中。
8.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤s1和s2中超声时间10min，离心转速为3500rpm，时间为10min。
