本发明涉及分子生物学，具体涉及一种鱼类dna条形码数据库及其基于线粒体基因组全序列构建方法与应用。
背景技术：
1、鱼类是水生生态系统的重要组成部分，鱼类的物种组成和遗传多样性是水生态系统健康状况的重要指标。水体污染、栖息地碎片化以及外来物种入侵导致鱼类资源衰退、群落结构失衡，通过开展鱼类资源调查监测可以掌握目标水域鱼类物种组成及其多样性，了解珍稀濒危鱼类种群状况，支撑物种保护、资源养护及栖息地修复。
2、目前，鱼类资源调查监测多采用网具捕捞鱼类样本，捕捞过程需要大量人力成本，对鱼类资源会产生一定程度的损害，同时还会扰动鱼类栖息生境。从调查监测效果分析，网具捕捞对于种群数量少、个体较小、隐蔽性高的鱼类捕获效果并不理想，且对调查人员的分类鉴定水平有较高的要求。环境dna技术具有采样无损伤、大尺度连续采样、高精度、低成本等特点，逐渐在鱼类资源调查监测中得到广泛应用。
3、dna条形码是环境dna技术的核心组成部分。dna条形码是指一段能够对应物种、相对保守且容易扩增的dna短片段，可用于物种识别。线粒体基因组具有快速进化、母系遗传、缺乏重组等特点，含有较高的拷贝数且可用于区分物种的保守序列较多，是用于dna条形码的良好材料。常用的线粒体基因有cytb、coi、12s、16s、d-loop等，片段大小在80-200bp，鱼类通用引物设计通常选择cytb、12s、coi等线粒体基因片段，其中12s基因使用最为广泛。利用引物对基因序列进行pcr扩增时，由于嵌合子、异源双链分子的形成以及taq dna聚合酶错误，会产生误差，所以序列扩增的效果很大程度上受到引物效率的影响。将扩增序列与dna条形码进行比对，根据序列重合率可确定物种分类地位，对于一些分化时间较短的近缘物种会出现难以区分的情况。线粒体全基因组测序过程不涉及pcr环节，可有效避免扩增过程中产生的误差；同时，全基因组测序获得的序列具有完整性，用其进行序列比对，能够弥补局部片段比对无法区分近缘物种的不足。
4、条形码数据库的建设是环境dna技术实施的基础。美国生物技术中心(ncbi)联合cbol在1982年建立了第一个数据库系统genbank，后在2004年生命条形码联盟(theconsortium for the barcode oflife，cbol)建立了生命条形码数据库系统bold(barcodeoflife data systems)，2007年加拿大建立了dna条形码鉴定中心。dna条形码技术是将用于物种鉴定的靶序列与数据库中的序列进行比对来确定物种信息，对数据库的丰富度及准确度要求较高，如果某个物种的dna序列未被收录进数据库中或收录的数据量较少以及错误的数据，就会出现比对失败和比对结果错误的情况。目前公共数据库中物种的全面性和序列的准确性无法满足特定研究的需求，存在目标水域中特有物种基因序列未被收录的情况，且已收录的序列准确性有待验证，因此根据研究需求构建精准、可溯源的自建数据库成为趋势。
5、鱼类线粒体基因组的长度大多在15-20kb左右，该长度远高于常见的dna条形码的长度，因此如能利用鱼类线粒体基因组全序列作为鱼类dna条形码，则能识别到更大范围的序列差异，物种鉴别的准确性将大大提高。利用线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法可以有效提高环境dna物种比对结果的精准度，且简化了技术步骤，更有利于环境dna监测技术的发展。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对现有鱼类公共数据库完整性不够、数据来源杂且质量参差不齐、区域针对性不足，可能导致小种群物种比对丢失、比对结果错误及无法有效排除非目标区域物种等假阳性结果，以及基因相似性高的近缘物种难以准确鉴定等技术问题，本发明提供一种鱼类dna条形码数据库及其基于线粒体基因组全序列构建方法与应用，利用线粒体全基因组构建鱼类条形码数据库，操作简便，可行性高。
2、技术方案：一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，步骤如下：
3、(1)确定鱼类名录；
4、(2)根据鱼类名录进行样品采集及鉴定，并进行标本保存；
5、(3)对标本进行dna提取；
6、(4)对提取的dna样品进行线粒体全基因组测序及分析；
7、(5)进行dna条形码建库。
8、作为优选，所述步骤(1)中确定鱼类名录时，基于目标水域的调查基础以及鱼类历史资料，以确定鱼类名录。
9、作为优选，所述步骤(2)中根据鱼类名录进行样品采集及鉴定，并进行标本保存，具体如下：根据鱼类名录进行样品采集，根据分类学依据鉴定物种，每个物种选取形态完好的个体拍摄形态特征照片，采集肌肉样品后制作成标本保存。
10、进一步地，优先采集目标水域的鱼类个体，若目标水域采集数量不足，则使用邻近水域的个体补充。
11、作为优选，所述步骤(3)中对标本进行dna提取，采用sds提取结合纯化柱法提取dna。
12、作为优选，所述提取方法如下：每种鱼类的3尾个体取背部肌肉，通过sds(十二烷基硫酸钠)提取结合纯化柱法提取总dna，每个样品取500mg肌肉，使用sds裂解液进行裂解，加入适量proteinase k和巯基乙醇，裂解过程轻柔颠倒混匀，放置室温冷却后离心，取离心上清液加入氯仿/异戊醇(24:1)抽提，抽提两次，异丙醇沉淀dna，轻微颠倒混匀后离心，弃掉废液，加入75％乙醇洗涤沉淀，重复两次，dna沉淀晾干后加入200ul te(tris-edta)溶解，rna酶消化，使用纯化柱(omega)进行纯化，纯化完成后使用ampure xpbeads试剂盒纯化，纯化后进行nanodrop和qbuit及电泳质检。
13、作为优选，所述步骤(4)中对提取的dna样品进行线粒体全基因组测序及分析，具体如下：采用covaris超声波破碎仪将样本基因组dna打断成300-500bp片段，对dna片段末端修复，在3′端加a碱基和测序接头；对连接产物进行pcr扩增，用磁珠回收产物并纯化，构建文库；文库构建完成后，先使用qubit 3.0进行初步定量，稀释文库，随后使用agilent2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量；dna文库质检合格后使用mgiseq-t7高通量测序平台进行双末端(paired end)测序；对测序数据进行质控过滤，使用uparse软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体，排除错误序列后，统计数据产量、碱基含量分布、数据质量分布，组装线粒体基因组并注释。
14、作为优选，所述步骤(5)中dna条形码的条目包括以下至少一种信息：物种中文名称、拉丁学名、分类地位、线粒体基因组序列、形态学图片、标本、肌肉样品、dna样品、采样点经纬度和采样时间。
15、一种如上述的方法构建的鱼类dna条形码数据库。
16、基于上述的鱼类dna条形码数据库在确定目标水域鱼类物种的分类阶元和相对丰度中的应用。
17、作为优选，步骤如下：在目标水域采集水体样本，使用微孔滤膜和真空抽滤装置富集水体样本中的dna，获得环境dna样本，对实验样本进行全序列短读长测序，基于上述dna条形码数据库，将测序结果利用bwa软件进行比对，对特异性比对的reads进行直接计数，对多重比对的reads依据比对序列的分类单元进行分类，整体通过数据库对应的分类学信息获得物种注释，确定目标水域鱼类物种的分类阶元和相对丰度。
18、有益效果：
19、(1)本发明提供的数据库包含的鱼类名录是基于目标水域的研究基础和历史资料收集，有效排除了比对结果的假阳性，提高了比对结果的可信度。
20、(2)本发明采用线粒体全基因组序列比对，弥补了局部片段比对无法区分近缘物种的不足。
21、(3)本发明规避了常规方法所需的pcr扩增环节，缩短了技术流程，简化了测序步骤，避免了因引物不匹配等而无法检出物种的情况。
1.一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述步骤(1)中确定鱼类名录时，基于目标水域的调查基础以及鱼类历史资料，以确定鱼类名录。
3.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述步骤(2)中根据鱼类名录进行样品采集及鉴定，并进行标本保存，具体如下：根据鱼类名录进行样品采集，根据分类学依据鉴定物种，每个物种选取形态完好的个体拍摄形态特征照片，采集肌肉样品后制作成标本保存。
4.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述步骤(3)中对标本进行dna提取，采用sds提取结合纯化柱法提取dna。
5.根据权利要求4所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述提取方法具体如下：每种鱼类的3尾个体取背部肌肉，使用sds裂解液进行裂解，加入proteinase k和巯基乙醇，裂解过程轻柔颠倒混匀，放置室温冷却后离心，取离心上清液加入氯仿/异戊醇抽提，抽提两次，异丙醇沉淀dna，轻微颠倒混匀后离心，弃掉废液，加入75％乙醇洗涤沉淀，重复两次，dna沉淀晾干后加入te溶解，rna酶消化，使用纯化柱进行纯化，纯化完成后使用ampure xp beads试剂盒纯化，纯化后进行nanodrop和qbuit及电泳质检，合格即可。
6.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述步骤(4)中对提取的dna样品进行线粒体全基因组测序及分析，具体如下：采用covaris超声波破碎仪将样本基因组dna打断成300-500bp片段，对dna片段末端修复，在3′端加a碱基和测序接头；对连接产物进行pcr扩增，用磁珠回收产物并纯化，构建文库；文库构建完成后，先使用qubit 3.0进行初步定量，稀释文库，随后使用agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量；dna文库质检合格后使用mgiseq-t7高通量测序平台进行双末端测序；对测序数据进行质控过滤，使用uparse软件，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体，排除错误序列后，统计数据产量、碱基含量分布、数据质量分布，组装线粒体基因组并注释。
7.根据权利要求1所述的一种基于线粒体基因组全序列构建鱼类dna条形码数据库的方法，其特征在于，所述步骤(5)中dna条形码的条目包括以下至少一种信息：物种中文名称、拉丁学名、分类地位、线粒体基因组序列、形态学图片、标本、肌肉样品、dna样品、采样点经纬度和采样时间。
8.一种如权利要求1所述的方法构建的鱼类dna条形码数据库。
9.基于权利要求8所述的鱼类dna条形码数据库在确定目标水域鱼类物种的分类阶元和相对丰度中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤如下：在目标水域采集水体样本，使用微孔滤膜和真空抽滤装置富集水体样本中的dna，获得环境dna样本，对实验样本进行全序列短读长测序，基于权利要求8的dna条形码数据库，将测序结果利用bwa软件进行比对，对特异性比对的reads进行直接计数，对多重比对的reads依据比对序列的分类单元进行分类，整体通过数据库对应的分类学信息获得物种注释，确定目标水域鱼类物种的分类阶元和相对丰度。
