本发明属于生物工程领域，具体涉及一种低分子果胶纳米硒复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
1、纳米硒(senps)是具有纳米尺寸特征的单质硒，因为它具有高生物活性、低毒性、高生物利用度、大比表面积和高颗粒分散性等独特优点，在食品、农业、畜牧业和水产养殖业中越来越受到关注，并在食品和医药相关领域发挥了一系列作用。然而，senps极易聚集沉淀，转变为热稳定的灰色单质硒，从而失去生物活性。多糖作为一种天然聚合物，由10余种单糖以糖苷键的形式连接而成。天然或经过改性的多糖含有多种官能团，比如羟基、氨基以及羧基等。这些官能团有助于在聚合物链上形成分子间和分子内的氢键，从而使包埋制备得到的senps保持稳定。近年的研究指出，se和多糖结合能够有效地缓解它本身存在的一些局限性，如稳定性差、颗粒过大、溶解度低以及生物利用率低等问题，并能够提升它们的生物活性，如抑菌和抗肿瘤活性等。
2、多糖纳米硒的制备方法有生物法、物理法和化学法等。生物法又分为生物细胞分泌包埋法和生物活性多糖直接包埋法。对于这些方法而言，生物活性多糖直接包埋法相较于其他几种方法具有反应速度快、实验操作简单和产品质量可控等优势，因此成为当前制备多糖纳米硒的主要方法。目前，采用多糖作为包埋剂或分散介质在制备多糖纳米硒过程中被广泛应用。此方法的关键在于利用抗坏血酸、谷胱甘肽等充当还原剂，将亚硒酸钠或二氧化硒转化为元素硒的零价态形式，随后使其与多糖的活性基团相互作用，从而生成纳米硒。在此过程中，通过调节反应条件，可以实现对纳米粒子形态的可控合成。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种低分子果胶纳米硒复合物及其制备方法和应用，本发明利用水解向日葵盘等来源的果胶，并通过聚醚砜膜得到低分子果胶来包埋制备纳米硒，其制备过程简单快捷可操作性强，制备而成的纳米硒粒径小，稳定性好，4℃储藏8周粒径无明显变化且不会产生沉淀，低分子果胶纳米硒复合物与未过膜的果胶纳米硒复合物相比较其抑菌、抗肿瘤能力得到了大幅度的提高，解决了纳米硒不稳定，容易自发聚集成团、沉淀，导致生物活性和生物利用度降低的问题。
2、本发明采用的技术方案如下：
3、一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，包括以下步骤：
4、1)低分子果胶裂解液的制备
5、将果胶按照1:50～1:200的料液质量比溶于超纯水中，将其ph调节至酸性，添加果胶酶，温度保持在30～60℃的条件下进行酶解反应，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至室温后离心除去底层沉淀，收集上清液即为酶解液；将酶解液过滤后，滤液中加入滤液体积0.5-2％的干酵母，在25-35℃下发酵25-45h，离心，收集上清液即获得发酵液；
6、将发酵液通过微滤装置(30kda的聚醚砜膜)将未酶解的果胶去除，然后通过10kda的聚醚砜膜将小分子多糖除去得到低分子果胶(sulmp)滤液，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩得到低分子果胶sulmp，同时将除去的小分子量多糖回收为果胶低聚糖(supo)。
7、2)低分子果胶纳米硒复合物的制备
8、将步骤1)低分子果胶sulmp与碘化钾、抗坏血酸和四价硒源混合，溶解于水中配成溶液，于水浴环境下搅拌反应，将所得反应液进行透析得到低分子果胶纳米硒复合物溶液，再将其冷冻干燥成粉末状固体，即可得到低分子果胶纳米硒复合物sulmp-senps。同时以相同的方法制备supo-senps和sp-senps。
9、进一步地，所述果胶酶为果胶裂解酶，酶解反应的反应液中果胶裂解酶的酶活浓度是5-15u/ml，优选为9-10u/ml。
10、进一步地，步骤1)中调节ph至4.0-6.0，优选ph为5.5，反应温度为30-60℃，优选为45℃，酶解时间是2-8h，优选为3h。
11、进一步地，步骤2)进行水浴反应的混合液中，低分子果胶的浓度是1.5～3.5mg/ml，优选为2.5mg/ml，抗坏血环酸浓度为20-40mm，优选为30-35mm，碘化钾的摩尔浓度是1-20mm，优选为10-15mm。
12、进一步地，步骤2)反应的温度为25-35℃，优选为30℃，反应时间是2～20h，优选8h，且产物需在黑暗中静置20-30h使其老化。
13、进一步地，步骤2)中，透析过程中包括将反应液转移到2500-3500da透析袋中，透析温度控制在2-6℃且避光的环境下，持续透析2-4天，优选为3天。
14、进一步地，步骤2)中，低分子果胶纳米硒复合物溶液放置在-20℃±2℃冰箱内预冻10-12h，然后将预冻的低分子果胶纳米硒复合物置于冷冻干燥机于-45～-55℃进行冷冻干燥30-40h，冷冻干燥机操作的真空度为0.09mpa以上。
15、本发明还提供所述的一种低分子果胶纳米硒复合物在制备抑菌或抗肿瘤药物中的应用。
16、果胶裂解酶(pl)作为果胶解聚酶的一种，果胶裂解酶(pl)则是一类通过β-反式消除作用切割α-1,4-糖苷键，降解去甲酯化果胶产生不同分子量寡聚糖的酶类。通过微滤装置收集得到低分子果胶，其富含的不饱和双键对低聚糖产物的生物活性具有显著影响。
17、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
18、1、以sp和其酶解得到的sulmp和supo为包埋剂，利用vc作为还原剂将na2seo3还原形成均一且稳定的sp-senps、sulmp-senps和supo-senps，sulmp-senps平均粒径为110.5nm，supo-senps平均粒径为57.5nm；在4℃储藏时，sulmp-senps更加稳定，在储藏8周后仍澄清透明且不会产生沉淀，有效的提高了生物利用度。
19、2、本发明得到的sulmp-senps对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有强抑制作用，对肝癌hepg2细胞也具有很强的抑制作用，并且抑制能力与浓度呈正相关。
20、3、本发明充分利用了向日葵盘农业废弃资源，更好地解决向日葵盘的再利用问题，减少环境污染。
1.一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于所述果胶酶为果胶裂解酶，酶解反应的反应液中果胶裂解酶的酶活浓度是5-15u/ml，优选为9-10u/ml。
3.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于步骤1）中调节ph至4.0-6.0，优选ph为5.5，反应温度为30-60℃，优选为45℃，酶解时间是2-8h，优选为3h。
4.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于步骤2）进行水浴反应的混合液中，低分子果胶的浓度是1.5~3.5mg/ml，优选为2.5mg/ml，抗坏血环酸浓度为20-40mm，优选为30-35mm，碘化钾的摩尔浓度是1-20mm，优选为10-15mm。
5.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于步骤2）反应的温度为25-35℃，优选为30℃，反应时间是2~20h，优选8h，且产物需在黑暗中静置20-30h使其老化。
6.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于步骤2）中，透析过程中包括将反应液转移到2500-3500da透析袋中，透析温度控制在2-6℃且避光的环境下，持续透析2-4天，优选为3天。
7.如权利要求1所述的一种低分子果胶纳米硒复合物的制备方法，其特征在于步骤2）中，低分子果胶纳米硒复合物溶液放置在-20℃±2℃冰箱内预冻10-12h，然后将预冻的低分子果胶纳米硒复合物置于冷冻干燥机于-45～-55 ℃进行冷冻干燥30-40 h，冷冻干燥机操作的真空度为0.09mpa以上。
8.如权利要求1-7任一所述方法制备的一种低分子果胶纳米硒复合物。
9.如权利要求8所述的一种低分子果胶纳米硒复合物在制备抑菌或抗肿瘤药物中的应用。
