本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多效微菌素壳聚糖纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术：
1、抗生素滥用导致的肠杆菌科细菌耐药性问题已引起国际社会的研究关注，为减少对抗生素的依赖并保障畜禽健康，无抗养殖已逐渐成为我国畜牧业未来的发展方向。此前，尚未有理想的替抗产品以应对畜禽养殖中常见的肠杆菌科细菌，而微菌素(microcin,mcc)在应对抗生素耐药性方面表现出巨大的潜力。套索肽(lasso peptides,lps)是一类由核糖体组装、翻译后修饰具有“套索”结构的小分子微菌素(<10kda)，具有稳定、高效的杀菌生物学活性。常见套索肽主要包括mccj25、mccy、klebsidin，它们进入细菌胞内后通过抑制rna聚合酶活性从而产生高效杀菌作用(mic＝0.001-1.0μg/ml)。前期研究发现，新型天然套索肽microcin y(mccy)，相较于mccj25具有明显沙门菌、志贺菌互补杀菌优势，而mccj25、mccy对克雷伯菌均表现为不敏感，但套索肽klebsidin对于克雷伯菌具有一定的抑制作用。相较于其他套索肽citrocin等，mccy、mccj25和klebsidin针对肠杆菌科细菌和革兰氏阳性菌具有较强的抑菌活性(mic＝0.001-20.0μg/ml)。尽管套索肽具有高效的杀菌优势，但是单一套索肽所针对的细菌具有靶向特异性；其次，套索肽类微菌素普遍存在酸碱不稳定性，对消化酶敏感也成为套索肽饲用过程中最大的障碍。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种多效微菌素壳聚糖纳米颗粒，所述纳米颗粒包含同时偶联的多种不同套索肽，协同多种不同套索肽之间的特异性抑菌作用，实现广谱抗菌作用。此外，这一纳米颗粒能够提高套索肽的酸碱耐受性和安全性，以突破畜禽饲用添加套索肽的应用瓶颈。
2、为了实现以上发明目的，本发明的第一方面，提供一种壳聚糖(chitosan，cn)纳米粒，所述壳聚糖纳米粒包括壳聚糖和一种以上的套索肽，所述套索肽具有羧基基团，所述壳聚糖结构中的氨基与套索肽的羧基通过酰胺键连接。
3、套索肽(lasso peptides,lps)是在细菌中发现的多肽类天然产物，是由核糖体合成并经过翻译后修饰产生的一类具有套索构型的生物活性肽。套索肽结构中通常含有14-33个氨基酸残基，其n端第1个氨基酸与第7，8或者第9个氨基酸侧链形成大酰胺环，而c端的氨基酸穿过此大酰胺环，形成标志性的“套索”结构。根据套索肽所含二硫键的数量和形成的位置不同可将其分为4类(如图8所示)。c端肽链与大肽环通过2个二硫键连接的套索肽被定义为ⅰ类套索肽(class i)；若肽链尾在穿出肽环之后，c端肽链与大肽环间无二硫键连接，而是通过空间相互作用稳定套索拓扑结构，则被称为ⅱ类套索肽(classⅱ)；若肽链尾c端方向序列与肽环之间只形成一个二硫键的套索多肽，根据其二硫键形成位置不同，分为ⅲ类或ⅳ类套索肽(classⅲ或classⅳ)，具体而言，ⅲ类套索肽的二硫键将肽环与肽链尾相连接，而ⅳ类的二硫键仅存在于肽链尾。所示4类套索肽都具有羧基基团。
4、在本发明的一些实施方式中，所述壳聚糖与套索肽的摩尔比为5:(3-4)。
5、在本发明的一些实施方式中，所述套索肽包括mccj25、mccy、klebsidin、citrocin、lihuanodin、synthetase b1、astexin 1、koveensin、mccs和mccc7。
6、在本发明的一些实施方式中，所述套索肽包括mccy和mccj25。
7、在本发明的一些实施方式中，所述套索肽包括mccy和klebsidin。
8、在本发明的一些实施方式中，所述套索肽包括mccj25和klebsidin。
9、在本发明的一些实施方式中，所述套索肽包括mccy、mccj25和klebsidin。
10、在本发明中，包括单一mccy套索肽的cn纳米粒(cn-mccy)对于粘质沙雷菌serratia marcescens和肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae没有抑菌作用；包括单一mccj25套索肽的cn纳米粒(cn-mccj25)对于鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium没有抑菌作用；包括单一klebsidin套索肽的cn纳米粒(cn-klebsidin)对于鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium没有抑菌作用。
11、进一步地，在本发明中，mccy和mccj25的联合使用对肠炎沙门菌salmonellaenteritidis、鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium、粘质沙雷菌serratia marcescens和肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae表现为相加抑菌作用，对金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus表现为协同抑菌作用；mccy和klebsidin的联合使用对肠炎沙门菌salmonella enteritidis、鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium、粘质沙雷菌serratiamarcescens表现为相加抑菌作用，对肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae和金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus表现为协同抑菌作用；mccj25和klebsidin的联合使用对肠炎沙门菌salmonella enteritidis、肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae和大肠杆菌escherichia coli表现为相加抑菌作用，对粘质沙雷菌serratia marcescens表现为协同抑菌作用。因此，包括mccy、mccj25和klebsidin套索肽的cn纳米粒(cn-lps)至少对于肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae、金黄色葡萄球菌s.aureus和粘质沙雷菌serratiamarcescens表现出协同作用，对于肠炎沙门菌salmonella enteritidis和鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium表现出相加抑菌作用。
12、在本发明中，包括mccy、mccj25和klebsidin套索肽的cn纳米粒(cn-lps)将微菌素的抑菌活性扩展到主要食源性病原体沙门菌属、沙雷菌属和克雷伯菌属。
13、在本发明的一些实施方式中，所述cn、mccy、mccj25和klebsidin的摩尔比为5:(1-2):1:1。
14、在本发明的一些实施方式中，所述壳聚糖纳米粒还包括精氨酸(arg)，所述壳聚糖结构中的氨基与精氨酸的羧基通过酰胺键连接。
15、在本发明的一些实施方式中，所述cn与arg的摩尔比为(1-10):1。
16、在本发明中，所述精氨酸通过酰胺键偶联至壳聚糖，从而提高壳聚糖纳米粒的酸碱稳定性。
17、在本发明的一些实施方式中，所述壳聚糖纳米粒的粒径为100-200nm。
18、在本发明的第二方面，提供一种壳聚糖纳米粒的制备方法，所述方法制备获得本发明第一方面的壳聚糖纳米粒。
19、在本发明的一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
20、1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液(nhs)混合，得到edcn混合溶液；
21、2)将壳聚糖和套索肽分别溶解于乙酰化溶液中，混合均匀，得到壳聚糖乙酰化溶液和套索肽乙酰化溶液；
22、3)将步骤1)中的edcn混合溶液分别加入步骤2)中的壳聚糖乙酰化溶液和套索肽乙酰化溶液中，混合均匀，得到壳聚糖-edcn混合溶液和套索肽-edcn混合溶液；
23、4)将步骤3)中的壳聚糖-edcn混合溶液与套索肽-edcn混合溶液依次混合，充分搅拌完成酯化反应，制备得到所述壳聚糖纳米粒。
24、在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)还包括精氨酸(arg)乙酰化溶液的制备，制备步骤包括：将精氨酸溶解于乙酰化溶液中，混合均匀，得到精氨酸乙酰化溶液。
25、在本发明的一些实施方式中，所述步骤3)还包括精氨酸-edcn混合溶液的制备，制备步骤包括：将步骤1)中的edcn混合溶液加入步骤2)中的精氨酸乙酰化溶液中，混合均匀，得到精氨酸-edcn混合溶液。
26、在本发明的一些实施方式中，所述步骤4)还包括与步骤3)中的精氨酸-edcn混合溶液进一步混合。
27、在本发明的一些实施方式中，所述乙酰化溶液包括乙酸钠溶液、乙酰氯溶液、乙酰酐溶液和冰醋酸溶液。
28、在本发明的一些实施方式中，所述乙酰化溶液包括乙酸钠缓冲液(sodiumacetate buffer,sab)。
29、在本发明的第三方面，提供本发明第一方面的壳聚糖纳米粒在制备具有抗菌作用的产品中的用途。
30、在本发明的一些实施方式中，所述菌包括沙门菌属、沙雷菌属和克雷伯菌属。
31、在本发明的一些实施方式中，所述沙门菌属包括肠炎沙门菌salmonellaenteritidis和鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium。
32、在本发明的一些实施方式中，所述沙雷菌属包括粘质沙雷菌serratiamarcescens。
33、在本发明的一些实施方式中，所述克雷伯菌属包括肺炎克雷伯菌klebsiellapneumoniae。
34、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括饲料、防腐剂、消毒剂和用于外创面感染的药物。
35、本发明的有益效果是：
36、1)本发明制备获得的包括壳聚糖和一种以上套索肽的壳聚糖纳米粒对多种菌具有多效协同抗菌作用，协同多种不同套索肽之间的特异性抑菌作用，从而实现广谱抗菌效果。
37、2)本发明制备获得的壳聚糖纳米粒中还通过酰胺键连接精氨酸(arg)，从而提高套索肽的酸碱耐受性突破了畜禽饲用添加套索肽的应用瓶颈。
38、3)本发明制备获得的壳聚糖纳米粒具有较高的安全性，在较高浓度下也不会造成溶血。
1.一种壳聚糖纳米粒，其特征在于，包括壳聚糖和一种以上的套索肽，所述套索肽具有羧基基团，所述壳聚糖结构中的氨基与套索肽的羧基通过酰胺键连接。
2.根据权利要求1的壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述套索肽包括mccj25、mccy、klebsidin、citrocin、lihuanodin、synthetase b1、astexin 1、koveensin、mccs和mccc7。
3.根据权利要求1的壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述壳聚糖与套索肽的摩尔比为5:(3-4)。
4.根据权利要求1的壳聚糖纳米粒，其特征在于，所述壳聚糖纳米粒还包括精氨酸，所述壳聚糖结构中的氨基与精氨酸的羧基通过酰胺键连接。
5.如权利要求1-3任一项所述的壳聚糖纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
6.如权利要求4所述的壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求5或6的制备方法，其特征在于，所述乙酰化溶液包括乙酸钠溶液、乙酰氯溶液、乙酰酐溶液和冰醋酸溶液。
8.如权利要求1-4任一项所述的壳聚糖纳米粒在制备具有抗菌作用的产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述菌包括沙门菌属、沙雷菌属和克雷伯菌属。
10.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述产品包括饲料、防腐剂、消毒剂和用于外创面感染的药物。
