本发明涉及核酸药物靶向递送系统领域，具体涉及一种脑靶向干细胞膜仿生阳离子脂质体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、随着社会的高速发展，诸如脑卒中、阿尔茨海默病、癫痫等脑疾病成为危害人民生命健康，极大影响人民生活水平的重大疾病。其中，缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率、高致死率和高复发率等特点。缺血性脑卒中病例占据脑卒中的80％以上，在临床治疗中，如组织型纤溶酶原激活剂等溶栓剂可以用于恢复血流，从而减少脑组织的缺血损伤，提高患者的生存率和神经功能恢复的可能性。但再灌注也会引发氧化应激反应并激活炎症途径，通过细胞分子的氧化损伤，炎症细胞浸润和炎症介质释放，基质金属蛋白酶上调以及紧密连接蛋白的调节，影响脑血管的结构完整性，造成血脑屏障二次破坏，加剧神经损伤。
2、基因药物因其具有广泛的靶点选择范围、高度特异性、可快速生产等优点，逐渐成为脑卒中研究中的焦点。其中，小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)和环状rna(circrna)等在卒中治疗领域中显示出巨大的治疗潜力，为未来的神经保护和功能恢复提供了新的方向。例如，靶向衔接蛋白p66(shc)的sirna通过沉默p66(shc)维持缺血再灌注后血脑屏障的结构完整性；脑组织中特异性表达的mir-124通过其抗炎、抗凋亡和促进神经再生等作用保护卒中后受损的神经；circscmh1通过增强神经元的可塑性、抑制神经胶质细胞激活和外周免疫细胞浸润等促进卒中后运动功能的恢复。
3、基因药物在脑部疾病治疗中面临诸多挑战，主要包括血脑屏障的穿透难题、易受核酸酶降解的不稳定性、以及负电荷导致的细胞膜穿透性差。纳米载体技术的发展为解决这些难题提供了新的策略。纳米载体具有提高药物稳定性、增强血脑屏障穿透能力以及促进细胞摄取等功能。其中，脂质体作为一种经典且商品化程度较高的纳米载体，不仅具有高载药能力和良好的生物相容性，还能通过其阳离子表面有效携载核酸药物并促进细胞内化。然而，阳离子脂质体的靶向性不足限制了其在脑部疾病基因治疗中的应用。
4、细胞膜仿生技术为提高纳米载体的脑靶向递送效率提供了一种创新性的解决策略。细胞膜仿生技术通过将细胞膜的生物功能性整合到纳米载体中，不仅简化了载体功能化制备过程，还显著提高了载体的多功能性和靶向性。细胞膜的选择决定了仿生载体的功能类型，其中，干细胞具有的天然炎症靶向性和低免疫源性等特点使其拥有向脑内靶向递送药物的潜能。干细胞膜表面的特定受体和配体如cxcr4、vla-4等可以在仿生载体表面发挥介导靶向递送的作用。此外，用于仿生修饰的细胞膜的纯度也会对载体的功能产生影响。假如细胞膜中混有核蛋白等能激发内源性免疫反应的细胞成分，则会增加其制备的仿生载体的免疫刺激性，最终对载体的靶向效率造成影响。目前用于分离提纯细胞膜的方法主要包括差速离心法、两相分配法以及密度梯度离心法，但尚未有统一标准。其中，密度梯度离心法可以通过精细的密度梯度设计实现对不同细胞组分的细致分离，具有进一步提高细胞膜纯度的潜力。但该方法操作过程相对复杂，其分离效果受多种参数影响，包括分散介质梯度设置、转速以及离心时长等。因此，建立一套标准化的操作方法对于确保实验的重复性、提高分离纯度及结果的可靠性至关重要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种可靶向脑部递送核酸的干细胞膜仿生阳离子脂质体及其制备方法和应用，可作为核酸药物靶向递送平台用于脑部疾病，特别是缺血性脑卒中治疗，解决核酸药物临床应用面临的靶向性弱、难以突破血脑屏障等难题。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明提供了一种干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)提取纯化获得干细胞膜；
5、(2)制备阳离子脂质体；
6、(3)将步骤(1)所得干细胞膜与步骤(2)所得阳离子脂质体融合，获得干细胞膜仿生阳离子脂质体，
7、其中，干细胞膜与阳离子脂质体的相对用量为：干细胞膜总蛋白量与阳离子脂质体总脂质量的质量比为1：2-24。
8、干细胞膜比例过大会减小载体表面正电位，降低它对带负电荷的核酸药物的携载能力；比例过小会导致没有足够数量的膜蛋白随干细胞膜一起被转移到阳离子脂质体上，大幅降低载体的脑靶向性。
9、优选的，干细胞膜与阳离子脂质体的相对用量为：干细胞膜总蛋白量与阳离子脂质体总脂质量的质量比为1：12。在本发明实施例中优先选择干细胞膜总蛋白量与阳离子脂质体总脂质量的质量比为1：12作为示例，但不限于此。
10、具体的，所述干细胞膜选自脐带来源间充质干细胞膜、胎盘来源间充质干细胞膜、骨髓来源间充质干细胞膜、神经干细胞膜以及诱导多能干细胞膜中的至少一种。
11、具体的，所述阳离子脂质体由阳离子脂质与中性脂质混合制备，其中，阳离子脂质与中性脂质的质量比为1：1-5。
12、具体的，所述阳离子脂质选自dotap((2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵)、dotma(氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、dospa(三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵)、ddab(双十八烷基溴化铵)、dogs(n-(2-精胺甲酰基)-n’，n’-双十八烷基甘氨酰胺)或dc-chol(3β-[n-(n’，n’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇)中的至少一种。
13、具体的，所述中性脂质选自spc(鞘氨醇磷酰胆碱)、dope(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dspc(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dppc(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dmpc(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dspe(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopc(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)或chol(胆固醇)中的至少一种。
14、优选的，选择阳离子脂质dotap与中性脂质spc以质量比2：3混合制备阳离子脂质体。
15、优选的，步骤(1)中，先通过反复冻融法提取干细胞膜，再通过密度梯度离心法纯化干细胞膜；
16、步骤(2)中，采用薄膜分散法制备所述阳离子脂质体。
17、所述纯化干细胞膜经连续两次蔗糖密度梯度离心分离提纯而获得，含较少细胞核成分，用于仿生修饰时具有较低免疫刺激性。
18、用纯度较高的干细胞膜修饰阳离子脂质体，制备得到的仿生载体既在不增加免疫刺激性的情况下继承了干细胞的天然炎症靶向性，又保留了阳离子脂质体高效携载核酸药物的能力，同时，囊泡结构有助于仿生载体变形，穿过生物体内狭窄的细胞间隙，突破生物屏障。
19、具体的，步骤(3)中，干细胞膜与阳离子脂质体融合时，在无核酸酶水或等渗溶液中融合；
20、所述等渗溶液选自山梨醇等渗溶液、葡萄糖等渗溶液或甘露醇等渗溶液中的至少一种。
21、干细胞膜与阳离子脂质体融合的参数如下：使用超声法进行融合，所述超声法的超声功率为15-30w，超声时间为3min(工作2s，休息3s)，超声次数为1-3次。在本发明实施例中，选择超声法的超声功率为20w，超声时间为3min(工作2s，休息3s)，超声次数为3次作为示例，但不限于此。
22、使用超声法制备干细胞膜仿生阳离子脂质体。该方法操作简便，且相较于挤出法具有更高的产率。
23、本发明还提供了所述制备方法制备的干细胞膜仿生阳离子脂质体。
24、本发明还提供了所述干细胞膜仿生阳离子脂质体在制备靶向脑部递送核酸药物的药物载体中的应用，所述核酸药物用于治疗脑部疾病。
25、所述核酸药物选自包括sirna、mirna、反义寡核苷酸在内的小核酸药物以及pdna中的一种。
26、优选的，所述脑部疾病为脑卒中(脑缺血再灌注损伤)、阿尔茨海默病、帕金森病、创伤性脑损伤、癫痫或脑肿瘤等。
27、本发明还提供了一种靶向脑部的基因药物，包括载体和核酸药物，所述载体为所述干细胞膜仿生阳离子脂质体，所述核酸药物用于治疗脑部疾病。
28、优选的，所述基因药物的氮磷比为2-10。氮磷比过小易超出载体的载药上限，引发载体间聚集；氮磷比过大会降低载体的载药量。更为优选的，所述基因药物的氮磷比为8。在本发明实施例中选择基因药物的氮磷比为8作为示例，但不限于此。
29、同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
30、(1)膜包被纳米粒要求其内核必须为负电性，否则易形成交联网状结构，无法将细胞膜包被至纳米粒表面，故较难实现核酸药物的携载与和递送。本发明实现了细胞膜对正电性材料的仿生修饰，通过将干细胞膜与阳离子脂质体进行融合组装构建了一种表面带正电荷的干细胞膜仿生阳离子脂质体，实现核酸药物高效携载和脑靶向递送。
31、(2)本发明基于密度梯度离心法建立了一套用于细胞膜分离提纯的标准化操作方法，可有效去除细胞膜中的细胞核成分，根据该方法获得的纯化干细胞膜用于仿生修饰具有低免疫刺激性。
32、(3)本发明使用纯化干细胞膜构建的干细胞膜仿生阳离子脂质体，具有高脑部靶向能力、低免疫刺激性以及高效核酸药物携载能力，能够突破血脑屏障，实现核酸药物向脑部包括神经元在内的细胞的高效靶向递送。
33、(4)本发明的制备方法简便，可作为核酸药物的靶向递送平台用于脑部疾病，特别是缺血性脑卒中靶向治疗，解决核酸药物临床应用面临的靶向性弱、难以突破血脑屏障等难题，具有良好的临床转化前景。
1.一种脑靶向干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，所述干细胞膜选自脐带来源间充质干细胞膜、胎盘来源间充质干细胞膜、骨髓来源间充质干细胞膜、神经干细胞膜以及诱导多能干细胞膜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体由阳离子脂质与中性脂质混合制备，其中，阳离子脂质与中性脂质的质量比为1：1-5；
4.根据权利要求1所述干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，先通过反复冻融法提取干细胞膜，再通过密度梯度离心法纯化干细胞膜；
5.根据权利要求1所述干细胞膜仿生阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，干细胞膜与阳离子脂质体融合时，在无核酸酶水或等渗溶液中融合；
6.权利要求1～5任一项所述制备方法制备的干细胞膜仿生阳离子脂质体。
7.权利要求6所述干细胞膜仿生阳离子脂质体在制备靶向脑部递送核酸药物的药物载体中的应用，所述核酸药物用于治疗脑部疾病。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脑部疾病为脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、创伤性脑损伤、癫痫或脑肿瘤。
9.一种靶向脑部的基因药物，其特征在于，包括载体和核酸药物，所述载体为权利要求6所述干细胞膜仿生阳离子脂质体，所述核酸药物用于治疗脑部疾病。
10.根据权利要求9所述靶向脑部的基因药物，其特征在于，所述基因药物的氮磷比为2-10。
