本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种nrep抑制剂的制备方法及其在皮肤纤维化中的应用。
背景技术：
1、纤维化疾病是一类以细胞外基质成分过度沉积为共同病理特征的疾病，因其高患病率以及伴随而来的组织功能障碍和严重并发症，被公认为全球健康问题。据统计，仅在工业化国家，纤维化疾病导致的死亡率就高达45％。如何逆转纤维化进程完成抗纤维化治疗是临床目前面临的重大挑战。典型的皮肤纤维化疾病主要包括增生性瘢痕、瘢痕疙瘩和系统性硬化症等，不仅造成巨大的医疗负担，还显著影响患者的生活质量。因此，深入探究皮肤纤维化发生机制，对开发新型药物抗纤维化治疗及改善患者的生存质量具有重要意义。
2、近年来，研究人员发现神经元再生相关蛋白(neuronal regeneration relatedprotein,nrep)可以特异性的介导成纤维细胞中的tgfβmrna的翻译，参与肝、肾、肺和皮肤等多种器官的纤维化发生过程。nrep，也称神经元蛋白3.1(p311)，是一种高度保守的8-kda细胞内蛋白，由studler等人于1993年首先报道在胚胎小鼠大脑高度中表达，后被发现在各种组织中广泛表达，如运动神经元、平滑肌细胞、表皮干细胞和成纤维细胞。并且，这些研究表明nrep广泛参与生理活动或疾病的发生过程，如脂肪代谢、血压稳态、学习和记忆中的行为反应、肿瘤侵袭、组织再生与纤维化等。在不同的器官组织中，nrep被证实均参与纤维化的发病过程。在肝纤维化研究中，sirna介导的nrep敲低降低了tgfβ诱导的肝星状细胞的迁移；nrep通过tgfβ1/smad信号传导促进肾纤维化；nrep通过刺激肺成纤维细胞中的tgf-β1、-β2和-β3翻译促肺纤维化发生；nrep在人增生性瘢痕中高表达，并且nrep缺失会导致真皮成纤维细胞tgf-βrii-smad信号通路受损以及瘢痕刚度和抗拉强度降低。以上研究表明nrep在跨器官纤维化的发展中具有保守的病理机制。
3、然而，目前的研究大多集中在内脏器官纤维化，而对皮肤纤维化的作用研究相对较少，并且以往研究中nrep对转化生长因子β家族的作用方向存在争议，对皮肤纤维化的作用方向尚不清楚。且不同皮肤纤维化疾病(增生性瘢痕、瘢痕疙瘩和系统性硬化症等)的发生存在差异，nrep调控皮肤纤维化的作用机制和靶点nrep实现临床转化还未见相关报道。
技术实现思路
1、本发明为克服上述现有技术所述的未有通过抑制nrep实现抑制皮肤纤维化、靶点nrep未发现存在临床转化的可能性的缺陷，提供一种nrep抑制剂；
2、本发明的另一目的在于提供一种nrep抑制剂的制备方法；
3、本发明的另一目的在于提供一种nrep抑制剂的应用。
4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
5、一种nrep抑制剂，为包含nrep-shrna基因的慢病毒颗粒；nrep-shrna基因序列的上链为
6、gatccgcaagaatcagttacctccactctcgagagtggaggtaactga ttcttgttttttg，
7、下链为
8、aattcaaaaaacaagaatcagttacctccactctcgagagtggaggta actgattcttgcg。
9、一种所述nrep抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
10、s1：合成nrep-shrna基因；
11、s2：将nrep-shrna基因克隆到转移质粒中，得到含nrep-shrna基因的转移质粒；
12、s3：将含nrep-shrna基因的转移质粒、包装质粒和包膜质粒共转染到包装细胞中；
13、s4：收集浓缩所得慢病毒颗粒，即为nrep抑制剂。
14、优选地，所述包装细胞为293t。
15、进一步地，所述转移质粒包括长末端重复序列、包装信号、启动子。
16、进一步地，所述转移质粒为慢病毒载体。
17、进一步地，所述包装质粒包括gag基因、pol基因和rev基因。
18、优选地，所述包装质粒为pspax2载体。
19、进一步地，所述包膜质粒包括vsv-g基因。
20、优选地，所述包膜质粒为pmd2.g载体。
21、利用分子克隆将nrep-shrna基因克隆到慢病毒载体中，慢病毒载体中含有病毒的基本元件5’ltr和3’ltr以及其他辅助元件及nrep-shrna序列。pspax2载体中的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pmd2.g载体中的vsv-g基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。通过转染试剂将上述三质粒共转染到包装细胞293t中，转录出的nrep-shrna与pspax2、pmd2.g基因翻译出的蛋白可组装成为慢病毒。
22、一种含nrep-shrna基因的转移质粒，由所述方法制备得到。
23、一种所述nrep抑制剂的应用，用于制备抑制皮肤纤维化的药物。
24、进一步地，用于制备降低tgf-β1、α-sma和col1a2蛋白水平表达量的药物。
25、进一步地，用于制备降低tgf-β1、α-sma和col1a2的mrna水平表达量的药物。
26、本发明明确了nrep在小鼠皮肤纤维化的形成过程中起到了促进作用，可通过转化生长因子β1信号通路促进ⅰ型胶原蛋白的分泌而促进纤维化的形成。nrep全身敲除与wt组相比，nrep全身敲除小鼠皮肤厚度及胶原密度降低；纤维化相关蛋白表达均降低；纤维化相关蛋白的mrna表达水平降。nrep条件敲除与control组相比，nrep条件敲除小鼠皮肤厚度及胶原密度降；同样分别检测了纤维化相关蛋白及mrna水平，nrep条件敲除小鼠的纤维化相关蛋白表达均降；纤维化相关的mrna表达水平降。
27、与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
28、通过注射本发明的nrep抑制剂(以慢病毒为载体)，皮肤厚度及胶原密度与nc组相比显著降低。具体来说，he染色和masson染色结果分别显示，nrep抑制剂显著减轻了皮肤纤维化程度，表现为皮肤真皮厚度和胶原沉积的显著减少。与此同时，无论是在蛋白水平还是在mrna水平上，纤维化相关蛋白(如tgf-β1、α-sma和col1a2)的表达水平均显著降低。通过本发明nrep抑制剂对靶点nrep的有效抑制，成功减轻了小鼠皮肤纤维化的形成。以上结果充分证明了本发明nrep抑制剂在抑制皮肤纤维化方面的显著效果，能够有效减少纤维化相关基因和蛋白的表达，显著改善皮肤纤维化的病理特征，表明本发明nrep抑制剂具有临床转化价值。
1.一种nrep抑制剂，其特征在于，为包含nrep-shrna基因的慢病毒颗粒；nrep-shrna基因序列的上链为gatccgcaagaatcagttacctccactctcgagagtggaggtaactga ttcttgttttttg，
2.一种权利要求1所述nrep抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述nrep抑制剂的制备方法，其特征在于，所述转移质粒包括长末端重复序列、包装信号、启动子。
4.根据权利要求2所述nrep抑制剂的制备方法，其特征在于，所述转移质粒为慢病毒载体。
5.根据权利要求2所述nrep抑制剂的制备方法，其特征在于，所述包装质粒包括gag基因、pol基因和rev基因。
6.根据权利要求2所述nrep抑制剂的制备方法，其特征在于，所述包膜质粒包括vsv-g基因。
7.一种含nrep-shrna基因的转移质粒，其特征在于，由权利要求2～3所述方法制备得到。
8.一种权利要求1所述nrep抑制剂的应用，其特征在于，用于制备抑制皮肤纤维化的药物。
9.根据权利要求8所述nrep抑制剂的应用，其特征在于，用于制备降低tgf-β1、α-sma和col1a2蛋白水平表达量的药物。
10.根据权利要求8所述nrep抑制剂的应用，其特征在于，用于制备降低tgf-β1、α-sma和col1a2的mrna水平表达量的药物。
