本发明涉及微生物，具体地说，涉及一种重组微生物及其在生产l-异亮氨酸中的应用。
背景技术：
1、l-异亮氨酸是八种必需氨基酸之一，因具有分支的甲基基团，故与l-缬氨酸和l-亮氨酸通称为“分支链氨基酸”。l-异亮氨酸作为合成蛋白质原料的补充剂，在动植物的生理代谢活动中是不可或缺的组成部分，广泛应用于医疗、饲料、制药、食品等方面。市场对l-异亮氨酸的需求日益扩大。目前工业化生产l-异亮氨酸的方法主要为提取法和发酵法等。传统的化学合成法因反应复杂、收率不高等问题已被淘汰。而提取法需用强酸水解动植物蛋白组织，容易造成环境污染。相比于提取法而言，发酵法因具有操作简单、成本低、对环境友好、绿色可持续发展等优点而被广泛应用。
2、在微生物体内，l-异亮氨酸是由tca循环中间代谢产物草酰乙酸经转氨基反应生成天冬氨酸，天冬氨酸经5步酶催化反应合成前体物质l-苏氨酸。l-苏氨酸经l-苏氨酸脱水酶（ilva编码）生成2-酮丁酸，从2-酮丁酸再经过4步酶反应合成l-异亮氨酸，最后4步参与反应的酶依次为乙酰羟酸合酶（ilvih编码）、乙酰羟酸异构还原酶（ilvc编码）、二羟基脱水酶（ilvd编码）、支链氨基酸转氨酶（ilve编码）。目前，强化异亮氨酸合成的策略主要集中在强化前体苏氨酸和苏氨酸到异亮氨酸的生物转化过程。对于如何提升异亮氨酸的合成仍有待进一步研究。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种发酵生产l-异亮氨酸的新方法。
2、本发明提供了一种重组微生物，其与出发菌株相比，表达cima突变体和ilvih突变体，过表达leubcd；所述出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；所述cima突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述ilvih突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示。
3、本发明对如何提高微生物体内的代谢前体2-酮丁酸（合成异亮氨酸的关键前体）供应进行了大量研究，发现通过引入 methanocaldococcus jannaschii来源的解除l-异亮氨酸反馈抑制的柠苹酸合酶突变体（cima）和ilvih突变体，获得了一种生产l-异亮氨酸的新途径。进而本发明提供了一种l-异亮氨酸代谢前体2-酮丁酸供应的新方法。通过在微生物中（如大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌）中引入外源的柠苹酸合酶（cima，ec 2.3.1.182）突变体可以催化乙酰辅酶a和丙酮酸生成柠苹酸，进一步通过菌株自身的leubcd基因的表达可以将柠苹酸转化为2-酮丁酸。利用该方法合成2-酮丁酸可以绕开菌株自身复杂的代谢调控，提高2-酮丁酸的合成效率，提高胞内2-酮丁酸/丙酮酸的比值，从而在原有基础上进一步提高异亮氨酸产量。
4、优选，本发明的重组微生物与出发菌株相比进一步过表达leubcd，以更好地将柠苹酸转化为2-酮丁酸。
5、更优选，本发明的重组微生物在表达cima突变体和ilvih突变体，过表达leubcd的同时，进一步过表达thrabc并表达ilva突变体。
6、此时，重组微生物可同时通过苏氨酸途径和柠苹酸合酶途径合成2-酮丁酸和l-异亮氨酸，两个通路协同提升l-异亮氨酸产量。
7、本发明的重组微生物中，所述cima突变体的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述leubcd的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述thrabc的核苷酸序列如seq id no.31所示。
8、本发明还提供上述重组微生物在发酵生产l-异亮氨酸、用于生产l-异亮氨酸的微生物遗传育种或提高生物法合成l-异亮氨酸的产量中的应用。
9、本发明还提供一种cima突变体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
10、本发明还提供一种dna分子，其核苷酸序列如seq id no.2、4或5所示。
11、本发明还提供上述dna分子在构建重组微生物中的应用，所述重组微生物可发酵生产l-异亮氨酸，出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
12、本发明的cima突变体可用于和其他基因改造组合使用，在重组菌中构建新的2-酮丁酸合成通路。
13、本发明还提供一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，其包括培养上述重组微生物的步骤。
14、本发明还提供一种构建生产l-异亮氨酸的重组微生物的方法，其包括使出发菌株表达cima突变体和ilvih突变体，或者进一步过表达leubcd，或者更进一步过表达thrabc并表达ilva突变体的步骤；所述出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；所述cima突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述ilvih突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述ilva突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述leubcd的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述thrabc的核苷酸序列如seq id no.31所示。
15、本发明的有益效果至少在于：
16、本发明提供了一种新的在微生物中生产2-酮丁酸和异亮氨酸的方法，其绕开了苏氨酸途径的复杂代谢调控，当与已知l-异亮氨酸合成途径（苏氨酸途径）同时存在时，可显著提高l-异亮氨酸的产量和得率。
1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比，表达cima突变体和ilvih突变体；所述出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比进一步过表达leubcd。
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比进一步过表达thrabc并表达ilva突变体；所述ilva突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，
5.权利要求1-4任一项所述的重组微生物在发酵生产l-异亮氨酸、用于生产l-异亮氨酸的微生物遗传育种或提高生物法合成l-异亮氨酸的产量中的应用。
6.一种cima突变体，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.一种dna分子，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2、4或5所示。
8.权利要求7所述的dna分子在构建重组微生物中的应用，所述重组微生物可发酵生产l-异亮氨酸，出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
9.一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，其特征在于，包括培养权利要求1-4任一项所述的重组微生物的步骤。
10.一种构建生产l-异亮氨酸的重组微生物的方法，其特征在于，包括使出发菌株表达cima突变体和ilvih突变体，或者进一步过表达leubcd，或者更进一步过表达thrabc并表达ilva突变体的步骤；所述出发菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌；所述cima突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述ilvih突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述ilva突变体的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述leubcd的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述thrabc的核苷酸序列如seq id no.31所示。
