本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种臭氧化油脂质体的制备及其评价方法，所述臭氧化油为臭氧化葵花籽油。
背景技术：
1、臭氧的抗菌特性被广泛认知和应用，然而其气体的不稳定性严重限制了其实际应用。为了克服这一问题，研究人员发现葵花籽油中的臭氧能够与不饱和键反应，形成稳定且具有治疗活性的臭氧衍生物。因此，可以利用臭氧化的葵花籽油来发挥这两种成分的抗菌潜力。臭氧主要通过其氧化性来杀灭细菌，氧化反应会导致细菌的细胞壁和质膜受损，从而增加细菌细胞对臭氧的渗透性。
2、近年来，纳米材料在医疗和组织工程方面的应用备受关注。纳米材料具有独特的物理化学性质，使其能够提供持久的效果并增强其稳定性。纳米材料的尺寸使得成分能够更有效地穿过皮肤，实现定向作用和毛孔渗透。脂质体是一种由脂质双亲性物质(如磷脂)组成的类球状囊泡，具有类似细胞膜的结构。脂质体由于其类生物膜结构的优势，在医药领域受到高度重视。因此，如何将植物精油的抗菌效果与纳米材料作为递送载体的优势结合起来，成为当前新型药物开发领域的热点研究方向。
技术实现思路
1、脂质体是一种安全有效的药物递送系统，制备简单且材料易得；臭氧化油价格低廉且具有显著的抗菌能力。因此，本发明选用脂质体作为递送载体，臭氧化油作为抗菌药物，以提高臭氧化油的生物利用度和增强其抗病原菌感染能力。
2、本发明采用脂质体作为载体来包埋和输送臭氧化油。研究重点在于探究脂质体壁材料含量、臭氧化油的载入以及表面活性剂等参数对臭氧化油脂质体的稳定性和抗菌性能的影响。在制备方法方面，研究了搅拌速度、滴加速度、超声功率和超声时间等因素，并对臭氧化油脂质体的稳定性、臭氧质量和抑菌性能等进行评估。最终得到了均一且稳定的臭氧化油脂质体。
3、具体来说，本发明提供了一种新型的臭氧化油脂质体制备方法及其评价方法，臭氧化油脂质体制备方法优化具体步骤如下：臭氧化油选择过氧化值为150mmol/kg的臭氧化葵花籽油，控制反应体系的总体积为50ml，将5-20％的臭氧化油、2-10％的不同种类型的表面活性剂(吐温20、吐温40、吐温60、吐温80)和2.5-20％的脂质材料加入反应容器中，控制反应容器的转速在500-1500rpm，使其混合均匀，形成均一的油相，后使用注射泵将适量的去离子水以10-100ml/h的速度滴加到油相中，之后搅拌形成o/w粗乳。最后使用细胞超声破碎仪控制时间为5-20min，超声功率为150-450w对粗乳进行超声，形成均一、稳定的臭氧化油乳液。同时本发明还进一步说明了其评价手段，对此，通过动力学稳定性和加速稳定性分析其稳定性，采用碘量法对其过氧化值进行检测，并以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为指示菌，通过悬液定量实验进行杀菌实验。结果表明，臭氧化油脂质体优化工艺条件下制备的产品稳定，过氧化值为34mmol/kg，通过抑菌结果说明其杀菌效果较强。
4、本发明的目的有两点，第一点提供一种新型臭氧化油脂质体及其制备方法，第二点提供一种新型臭氧化油脂质体的评价方法。
5、具体来说，本发明提供如下技术方案：
6、一方面，本发明提供臭氧化油脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
7、a.准备臭氧化油作为载入对象；
8、b.将臭氧化油、表面活性剂、磷脂混匀搅拌形成均一，清澈的油相；
9、c.将去离子水作为水相，加入油相中，形成水包油臭氧化油脂质体；
10、d.使用细胞超声破碎仪将形成的水包油臭氧化油脂质体进行超声，从而形成均一、稳定的臭氧化油脂质体；
11、e.将制备得到的臭氧化油脂质体在2-8℃的环境下保存。
12、在一些实施方案中，所述臭氧化油为臭氧化葵花籽油。
13、在一些实施方案中，所述臭氧化油的体积百分比含量为5-20％。
14、在一些实施方案中，所述臭氧化油的体积百分比含量为20％。
15、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80。
16、在一些实施方案中，所述表面活性剂为吐温80。
17、在一些实施方案中，所述表面活性剂的体积百分比含量为2-10％。
18、在一些实施方案中，所述表面活性剂的体积百分比含量为10％。
19、在一些实施方案中，所述磷脂体积百分比含量为2.5-20％。
20、在一些实施方案中，所述磷脂的体积百分比含量为5％。
21、在一些实施方案中，水相与油相的体积比为7：1-3：1。
22、在本发明中，臭氧化油、表面活性剂、磷脂属于油相。
23、在一些实施方案中，搅拌速度为500-1500rpm。
24、在一些实施方案中，搅拌速度为500rpm。
25、在一些实施方案中，去离子水的滴加速度为10-100ml/h。
26、在一些实施方案中，去离子水的滴加速度为60ml/h。
27、在一些实施方案中，步骤d中超声功率为150-450w，超声时间为5-20min。
28、在一些实施方案中，步骤d中超声功率为350w，超声时间为10min。
29、另一方面，本发明提供臭氧化油脂质体，其通过如上所述的方法制备获得。
30、另一方面，本发明提供臭氧化油脂质体的评价方法，所述评价方法包括稳定性分析、臭氧质量分析和抑菌性能分析。
31、在一些实施方案中，用粒径和多分散系数评价所制备的臭氧化油脂质体的性能。
32、在一些实施方案，所述粒径、多分散系数分析采用粒径分析仪进行。
33、在一些实施方案，所述稳定性分析选自动力学稳定性分析和加速稳定性分析。
34、在一些实施方案中，所述动力学稳定性分析为将脂质体转入试管中，分别在4℃、25℃、40℃保存30天，储存后，在7、14、21、28天内观察脂质体顶部的奶油层和底部的沉淀层，判断其稳定性。
35、在一些实施方案中，所述加速稳定性分析为将脂质体静置在4℃冰箱48h，然后将其转移至45℃的恒温箱中静置48h，从而得到一个循环，依次按此步骤重复6次后，1500转/分钟下离心30分钟，观察脂质体顶部的奶油层和底部的沉淀层，判断其稳定性。
36、在一些实施方案中，臭氧质量分析采用碘量法进行。
37、在一些实施方案中，所述碘量法为称取2.5000g臭氧化油脂质体样品于250ml碘量瓶中，加入30ml氯仿-冰醋酸(2：3v/v)混合液，轻摇使其混合均匀，加入1ml饱和碘化钾(ki)溶液，盖好瓶盖，轻摇0.5min，置于暗处3min，然后加入100ml蒸馏水，摇匀后用0.1mol/l硫代硫酸钠溶液滴定，滴定至淡黄色时，滴定时要剧烈搅拌，加1ml淀粉指示剂，溶液由淡黄色变为蓝色，继续滴定至蓝色消失，即为终点，记录滴定硫代硫酸钠体积，每个样品重复检测三次。其中葵花籽油为空白组，臭氧化油脂质体为实验组，测定出臭氧化油脂质体的过氧化值，然后利用过氧化值-臭氧质量标准曲线，将过氧化值带入标准曲线中，计算出臭氧化油脂质体的臭氧质量，
38、过氧化值计算公式如下：
39、
40、式中，pi为过氧化值，m为硫代硫酸钠浓度(0.1mol/l)，v为消耗的硫代硫酸钠体积(ml)，m为样品质量(g)。
41、在一些实施方案中，抑菌性能分析以金黄色葡萄球菌与白色念珠菌为指示菌。
42、在一些实施方案中，抑菌性能分析包括取0.01ml的稀释的菌悬液(浓度10-300cfu/ml)，在无菌环境下，用灭菌过的涂布器均匀的涂抹在固体培养基表面，孵育一段时间，然后取0.1ml的臭氧化油脂质体均匀的涂抹在培养基表面，处理后放置37℃培养箱，培养24h，观察培养基表面，计数菌落总数，单位cfu/ml，其中，设置生理盐水作为空白组，相同过氧化值的臭氧化油(采用葵花籽油进行稀释)作为阳性对照，杀菌率计算公式：
43、
44、其中：n0为对照组的菌落总数，n1为样品处理的菌落总数。
45、定义
46、o/w：是水包油体系，将油分散在水中的乳化体系，油为内相，水为连续的外相。
47、pdi：多分散系数，代表粒子均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，溶液中的粒子分布越均匀。相反，该数值越大，溶液中的粒子分布越宽泛。
48、吐温20：也称为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，亲水性较强。
49、吐温40：也称为聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯，为油/水型乳化剂，用作稳定剂、增溶剂、扩散剂、抗静电剂、纤维润滑剂等。
50、吐温60：也称为聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬酸酯，是一种常用的非离子型表面活性剂，具有乳化、增溶、去污等作用。
51、吐温80：也称为失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，由失水山梨醇单油酸酯与环氧乙烷聚合而成。是一种化工原料。
52、有益效果
53、纯的臭氧化油是油状，只可进行皮肤表面的涂抹，且臭氧化油的过氧化值会随着储存时间的延长而降低，从而降低其性能。与现有的技术相比，本发明具有以下效果，首先本发明解决传统的臭氧化油局限于皮肤涂抹问题，拓展臭氧化油的应用市场，其次通过脂质体包裹会大大增加臭氧化油的储存稳定性，延长了臭氧化油储存时间，开发了一种稳定好、剂型多样(例如将臭氧化油制备成脂质体悬浮液后可进行注射等)的臭氧化油纳米脂质体，其次本发明通过实验室工艺开发，评价理化性能、分析稳定性及抑菌性能研发一种新型臭氧化油脂质体。
1.臭氧化油脂质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述臭氧化油的体积百分比含量为5-20％，优选为20％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂的体积百分比含量为2-10％，优选为10％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述磷脂体积百分比含量为2.5-20％，优选为5％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，水相与油相的体积比为7：1-3：1。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，搅拌速度为500-1500rpm，优选为500rpm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，去离子水的滴加速度为10-100ml/h，优选为60ml/h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d中超声功率为150-450w，超声时间为5-20min，优选超声功率为350w，超声时间为10min。
9.臭氧化油脂质体，其通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法制备获得。
10.臭氧化油脂质体的评价方法，其特征在于，所述评价方法包括稳定性分析、臭氧质量分析和抑菌性能分析，优选地，所述稳定性分析选自动力学稳定性分析和加速稳定性分析。
