本发明涉及属于有机合成，具体涉及一种甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法。
背景技术：
1、肌肽（l-carnosine)是一种天然的二肽，其化学名称为β-丙氨酰-l-组氨酸。肌肽具有很强的抗氧化能力，对人体有益。肌肽具有抗炎、抗糖化、抗氧化作用，可作为一种非处方食品补充剂，在预防和辅助治疗心血管疾病和神经退行性等慢性疾病方面具有一定的作用。在动物实验里，肌肽的神经保护机制可以防止永久性脑部缺血。补充肌肽被认为有助于缓解部分与年龄有关的神经疾病，例如阿尔茨海默症、帕金森症等。肌肽还是一种重要的细胞内抗氧化剂。肌肽不仅无毒，而且具备强的抗氧化性，因此以它作为一种新型的食品添加剂与药用试剂已经引起广泛关注。在医学上，肌肽还可以防止预防阿滋海默症，防止神经和脑部退化。甘氨酸是化学结构最简单的氨基酸。尽管结构简单，甘氨酸在中枢神经系统中却是一种重要的抑制性神经递质，在控制神经元兴奋性方面发挥重要作用。甘氨酸-β-丙氨酰-l-组氨酸（甘氨酰-l-肌肽）则是将甘氨酸与肌肽通过肽链连接起来组成的三肽，水溶性较强，其具有显著的生物活性，其神经保护功能大大强于肌肽或甘氨酸，在脑卒中，脑损伤，阿尔茨海默症、帕金森症等领域具有广阔的应用前景（李健雄，专利公开号：cn113150065a，2021/07/23，一种合成肽及其应用，us20240002435）。本专利开发了甘氨酰-肌肽（甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸）的液相合成方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明实施例提供了一种甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，本合成方法具有收率高、过程简单和纯度高等优点，仅四步反应可得到三肽甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸（甘氨酰-l-肌肽），其中两步不用后处理分离，大幅降低了生产周期和生产成本，前三步基本都可以在室温下进行，条件温和。合成路线如下所示：
2、。
3、本发明提供了一种甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，所述方法包括：
4、(1)在溶剂a中，于0-25℃下l-肌肽、硅烷保护剂和敷酸剂反应得到三硅烷-肌肽，所述硅烷保护剂选自三甲基氯硅烷或六甲基二氮硅烷，所述敷酸剂选为三乙胺或二异丙基乙胺，所述l-肌肽与三甲基氯硅烷的摩尔比为1：3.0-4.5，所述l-肌肽与六甲基二氮硅烷的摩尔比为1：1.5-2.5，所述l-肌肽与敷酸剂的摩尔比为1：4.0-6.5。在该步骤中，l-肌肽通过硅烷保护羧基和两个氨基，转化为三硅烷-肌肽。其中，丙氨酸上的氨基的两个氢，在本专利的条件下仅有一个氢进行硅烷保护，另一个氢不反应以进行接肽反应。原因为：l-肌肽有位阻影响，在弱碱下只替换一个氢，若碱非常强，如正丁基锂等可以替换两个，本专利恰好只需替换一个，另一个成肽。
5、(2)三硅烷-肌肽与邻苯二甲酰甘氨酰氯缩合得到邻苯二甲酰甘氨酰三硅烷肌肽。该步骤中，无需加入缩合剂。
6、(3)步骤(2)的反应液加水淬灭，水相加酸调整至ph值至2-3，水解得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽。在该步骤中，三个硅烷保护基均同时被去除。
7、(4)邻苯二甲酰甘氨酰肌肽肼解得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸，为常规的肼解过程。
8、其中，溶剂a选自二氯甲烷、四氢呋喃或1,2-二氯乙烷等，优选为二氯甲烷。具体地，溶剂a选自二氯甲烷，在步骤(1)中，在氮气保护下，于二氯甲烷中加入l-肌肽和敷酸剂，在悬浮液状态下滴加硅烷保护剂，在0-25℃下反应，滴加的过程中l-肌肽缓慢溶解，反应完成后得到三硅烷-肌肽溶液。
9、其中，步骤(2)具体包括：将邻苯二甲酰甘氨酸和催化剂dmf溶于溶剂b中，再滴加酰化剂，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液。邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液不经过处理直接与三硅烷-肌肽溶液反应，在三硅烷-肌肽溶液中加入催化剂dmap，再滴加邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰三硅烷肌肽。其中，邻苯二甲酰甘氨酸、dmf和酰化剂的摩尔比为1：0.01-0.05：1-2，三硅烷-肌肽与邻苯二甲酰甘氨酰氯的摩尔比为1：1.1-1.5。其中，溶剂b选自二氯甲烷、四氢呋喃或1,2-二氯乙烷等，优选为二氯甲烷。酰化剂选自氯化亚砜或草酰氯等，优选为草酰氯。
10、其中，步骤(3)包括：将步骤(2)的反应滴加至冰水中进行淬灭，淬灭完成后分液，有机相用水萃取，合并水相，加酸调整ph值至2-3进行水解，水解完成后，浓缩（分离大部分水，如80%的水），加入沉淀剂，固液分离得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽。其中，沉淀剂选自乙醇、异丙醇、甲醇或丙酮等，优选为异丙醇。沉淀剂的用量为l-肌肽重量的15-25倍。酸为常见酸即可，具体可以为浓盐酸。
11、其中，步骤(4)包括：邻苯二甲酰甘氨酰肌肽与水合肼醇溶液在70-80℃下肼解，肼解完成后，回收溶剂和纯化后得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸。水合肼醇溶液的体积浓度为20-60%，具体地，水合肼醇溶液的体积浓度为30%。水合肼醇溶液选自水合肼甲醇溶液、水合肼乙醇溶液或水合肼异丙醇溶液等，优选为90%的水合肼乙醇溶液。
12、其中，步骤(4)的纯化过程为：在反应产物中加入水，再通过萃取除杂，水相通过活性炭进行脱色，脱色完成后固液分离（具体为趁热过滤），蒸干水得到糊状物，重结晶得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸。其中，活性炭的用量为邻苯二甲酰甘氨酰肌肽重量的1-10%，萃取剂选自二氯甲烷或甲苯等，优选为二氯甲烷。重结晶溶剂选自乙醇、异丙醇、甲醇或丙酮等，优选为乙醇。其中，脱色反应的时间为10-60分钟，具体可以为20分钟。
13、具体地，本发明提供了一种甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，所述方法包括：
14、(1)在氮气保护下，于二氯甲烷中加入二异丙基乙胺和l-肌肽，在悬浮液状态下滴加三甲基氯硅烷，在0-25℃下反应，反应完成后得到三硅烷-肌肽溶液。其中，l-肌肽、三甲基氯硅烷和二异丙基乙胺的摩尔比为1：3.0-4.5：4.0-6.5。
15、(2)将邻苯二甲酰甘氨酸和催化剂dmf溶于二氯甲烷中，再滴加草酰氯，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液；在三硅烷-肌肽溶液中加入催化剂dmap，再滴加邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰三硅烷肌肽。其中，邻苯二甲酰甘氨酸、dmf和草酰氯的摩尔比为1：0.01-0.05：1-2，三硅烷-肌肽与邻苯二甲酰甘氨酰氯的摩尔比为1：1.1-1.5。
16、(3)将步骤(2)的反应滴加至冰水中进行淬灭，淬灭完成后分液，有机相用水萃取，合并水相，在水相中加盐酸调整ph值至2-3进行水解，水解完成后，浓缩，加入异丙醇，固液分离得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽。
17、(4)将邻苯二甲酰甘氨酰肌肽加入到水合肼乙醇溶液中，在70-80℃下肼解，肼解完成后，回收乙醇；在反应产物中加入水，再通过二氯甲烷萃取除杂，然后水相通过活性炭进行脱色，脱色完成后固液分离，蒸干水得到糊状物，最后通过乙醇溶液重结晶得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸。其中，活性炭的用量为邻苯二甲酰甘氨酰肌肽重量的1-10%。
18、本发明提供的合成方法具有如下优点：直接采用市场化的l-肌肽为起始原料，不用再在反应中考虑丙氨酸与组氨酸的肽链连接问题，直接过量三甲基氯硅烷在二氯甲烷中上硅烷保护，l-肌肽的丙氨酸氨基和组氨酸环上氨基及羧基全部为硅烷所保护，反应完成后直接与邻苯二甲酰甘氨酰氯发生缩合，l-肌肽的丙氨酸氨基上剩余的一个活化氢与酰氯缩合成肽键，后处理水解得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽，结晶提纯后简单乙醇水合肼肼解，得到甘氨酰-l-肌肽（甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸）。传统方法无法避免甘氨酸和组氨酸环上的氨基发生反应，通常需要多次保护脱保护处理，收率很低（收率通常在10-20%），不能满足生产需要。本发明流程简单，两步反应产物三硅烷肌肽和邻苯二甲酰甘氨酰氯无需提纯拿出，直接缩合水解结晶得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽（邻苯二甲酰甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸），进一步提纯后简单的醇类水合肼肼解，萃取除杂后调等电点（具体为中性）后醇类结晶出固体，得到三肽甘氨酰-l-肌肽（甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸）。三肽甘氨酰-l-肌肽（甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸）也可以通过固相合成方法合成，但成本高，不适合大规模产业化生产（李健雄，专利公开号：cn113150065a，2021/07/23，一种合成肽及其应用，us20240002435）。
1.甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述溶剂a选自二氯甲烷、四氢呋喃或1,2-二氯乙烷。
3.根据权利要求2所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述溶剂a选自二氯甲烷，在步骤(1)中，在氮气保护下，于二氯甲烷中加入l-肌肽和敷酸剂，在悬浮液状态下滴加硅烷保护剂，在0-25℃下反应，反应完成后得到三硅烷-肌肽溶液。
4.根据权利要求3所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：将邻苯二甲酰甘氨酸和催化剂dmf溶于溶剂b中，再滴加酰化剂，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液；在三硅烷-肌肽溶液中加入催化剂dmap，再滴加邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液，在0-25℃下反应得到邻苯二甲酰甘氨酰三硅烷肌肽，所述邻苯二甲酰甘氨酸、dmf和酰化剂的摩尔比为1：0.01-0.05：1-2，所述三硅烷-肌肽与邻苯二甲酰甘氨酰氯的摩尔比为1：1.1-1.5。
5.根据权利要求4所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述溶剂b选自二氯甲烷、四氢呋喃或1,2-二氯乙烷，所述酰化剂选自氯化亚砜或草酰氯。
6.根据权利要求4所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(3)包括：将步骤(2)的反应滴加至冰水中进行淬灭，淬灭完成后分液，有机相用水萃取，合并水相，加酸调整ph值至2-3进行水解，水解完成后，浓缩，加入沉淀剂，固液分离得到邻苯二甲酰甘氨酰肌肽。
7.根据权利要求6所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述沉淀剂选自乙醇、异丙醇、甲醇或丙酮，所述沉淀剂的用量为l-肌肽重量的15-25倍。
8.根据权利要求1所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(4)包括：邻苯二甲酰甘氨酰肌肽与水合肼醇溶液在70-80℃下肼解，肼解完成后，回收溶剂和纯化后得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸；所述水合肼醇溶液的体积浓度为20-60%，所述水合肼醇溶液选自水合肼甲醇溶液、水合肼乙醇溶液或水合肼异丙醇溶液。
9.根据权利要求8所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(4)的纯化过程为：在反应产物中加入水，再通过萃取除杂，水相通过活性炭进行脱色，脱色完成后固液分离，蒸干水得到糊状物，重结晶得到甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸，所述活性炭的用量为邻苯二甲酰甘氨酰肌肽重量的1-10%，所述萃取剂选自二氯甲烷或甲苯，所述重结晶溶剂选自乙醇、异丙醇、甲醇或丙酮。
10.根据权利要求1所述的甘氨酰-β-丙氨酰-l-组氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
