本发明涉及纳米药物领域，涉及一种可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的制备和应用。
背景技术：
1、溶瘤病毒(oncolytic viruses,ovs)代表了一种新兴的免疫治疗方法。近年来，在黑色素瘤和胶质瘤等疾病的临床试验中取得了显著进展。然而，针对弥漫性或复发性肿瘤患者，往往需要结合放射治疗(rt,radiotherapy)来提高治疗效果。尽管如此，我们仔细审视这些相关的临床试验，发现了一些亟待解决的问题。首先，ovs的抗原利用率低，而肿瘤rt后会产生大量抗原。此外，ovs联合rt的临床应用主要限于瘤内注射，这大大限制了它们对深部和转移性病变的治疗效果。其次，虽然通过静脉输注ovs来治疗转移性肿瘤和深部器官来源的肿瘤似乎是一种更好的方法，但在临床实践中，静脉给药的疗效远未达到预期。ovs一旦进入血液循环，其表面抗原蛋白的异源性能够激活人体自身的免疫系统，导致外周血中的抗体和补体与病毒结合，形成免疫复合物，并促使病毒被免疫器官如肝脏和脾脏等内吞清除，从而大幅减少了ovs在外周血液中的循环时间。因此，目前迫切需要开发更多的给药途径以扩大ovs疗法的应用范围。同时，我们还需努力寻找方法，以放大ovs结合rt对肿瘤细胞的清除能力，例如增强ovs的感染能力以强化dna损伤效果和特异性免疫清除肿瘤的能力，这些都是我们需要克服的挑战。
2、化学修饰和生物膜包裹已被证实可以显著优化治疗药物在体内的药代动力学特性。基于阳离子化合物进行化学修饰基因传递载体，能够提高目标细胞的摄取率，其中聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,pei)以其卓越的核酸凝聚和稳定能力而著称。在病毒基因传递领域，由于其优越的转基因表达诱导性，pei常被视为“黄金标准”，并已被证实比其它常用的阳离子聚合物如壳聚糖和聚酰胺更加有效。pei与核酸的复合体可以通过简单混合可重复地制备。此外，pei多链体在室温下稳定，可允许长期储存其冷冻复合物而保持足够的活性。pei存在两种不同的化学结构形式，即支链和线性pei。在低分子量条件下，pei常与可生物降解的联结剂交联，以保持优良的核酸凝聚性，同时提高生物相容性。支链pei通过氮丙啶的开环聚合来合成，线性pei则通过对其他聚合物(如聚(2-恶唑啉))后改性获得。这两种合成方法均已详细描述，并为大规模生产提供了高效且具成本效益的途径。pei载体因胺基的广泛存在而具多功能化特性，适应各种基因传递的需求。
3、腺病毒入侵宿主细胞依赖于受体与配体之间的相互作用，而低表达柯萨奇与腺病毒受体(car)的细胞对ad病毒的感染效率较差。为了提高ad病毒的感染效率，研究者们开发了一种包被胆汁酸共轭pei的ad复合物(ad/da3)。ad/da3在car表达中等或car阴性的癌细胞中显著提升了感染效率。与裸露的ad相比，rdb-kox/da3在人类肿瘤异种移植模型中显著增强了细胞凋亡，降低了血管生成，减少了细胞增殖，并加强了活性病毒的复制。这些结果表明，经pei修饰的ad病毒能够提升溶瘤ad病毒治疗的疗效，尤其是在car受限性肿瘤中。
4、由于pei带正电，而肿瘤抗原通常带负电，pei具备捕获带负电抗原的潜力。类似于前述ad-mal，未能及时进入肿瘤细胞的ad-pei也有潜力将捕获的抗原引流至淋巴结，激发特异性的免疫杀伤作用。但与mal相比，与抗原结合的稳定性及效率有待进一步考察。此外，重要的是pei还可以作为递送抗原的载体，增强先天性和适应性免疫反应，显示出免疫佐剂的特性。含蛋白酶的内体负责细胞内分选，疫苗复合物的内体逃逸对于有效抗原释放至关重要。内溶酶体的降解可能会妨碍有效释放。内体内的ph值会因膜结合atp酶泵的作用而从早期内体的生理ph值7.4降至溶酶体的ph值5.0。pei几乎在所有ph值下都表现出高缓冲能力，因此是一种具备高内体逃逸活性的化合物。在内体酸化后，阳离子pei可通过“质子海绵”效应导致内体破裂；质子化引起氯离子的被动内流，随后是水的流入，最终导致渗透膨胀和内体破裂，使得pei基疫苗逃逸至囊泡内部。基于pei的疫苗中的抗原逸出内体后，通过交叉呈递机制激发t细胞的特异性免疫反应。此外，基于pei的疫苗具有促进全身免疫反应的免疫反应性。一项研究发现通过体内免疫研究发现，pei能激活混合型th1/th2免疫反应中的cd8和cd4 t细胞。然而，pei免疫的具体作用机制尚不明确。pei的免疫活性可能归因于激活多种分子通路，如tlr通路、含pyrin结构域的nlrp3炎症体通路和危险信号通路。因此，用pei修饰的ovs(ovs-pei)有望通过增强病毒感染性来加强rt后的dna损伤，并且ovs-pei也能通过捕获和递呈抗原来强化rt后的免疫杀伤作用。
5、然而，pei所带的大量正电荷对于静脉注射不利。此外，采用peg等聚合物方法已能显著提长药物的血液循环半衰期并提升其生物相容性。而且，将药物封装于生物膜内可以优化其在体内的分布，并借助生物体内的天然归巢特性实现同源靶向。因此，对ovs-pei进行peg化或生物膜修饰可促进该复合物的静脉注射应用。但是，作为一种具有生物活性的实体，在接受化学修饰或包裹于生物膜时，ovs可能会遭受显著的感染性能损失。因此，在静脉输注ovs-pei时，最大的挑战在于开发能在到达肿瘤微环境后移除保护层，以此恢复病毒的原有感染性能的策略。
6、纳米药物的受控释放，凭借其响应性，不仅能确保靶向药物的精准递送，还能在接收到激活信号时，通过分子结构的重排来精确地解构保护性纳米壳。这类响应系统被设计来利用肿瘤微环境固有的特殊理化特性，例如增强的通透性、酸性ph值或者过量表达的酶。在外源方面，外部激发因素如磁场、聚焦超声或rt的引入，进一步扩充了纳米药物在精确导航和药物释放方面的策略库。特别值得关注的是，活性氧(reactive oxygen species,ros)响应型聚合物载体的合成及其在医学上的应用已激发了广泛的研究兴趣。众多用于药物递送系统的ros响应型聚合物已被开发，并在治疗效果上显示出优于传统药物递送方式的优势。目前，探索了多种不同类型的ros响应型聚合物载体，包括含硫醚聚合物、含硒(selenium,se)/碲聚合物、芳基硼酸/含酯聚合物、芳基草酸酯和聚脯氨酸等。这些ros响应型聚合物通常造成化学键断裂和/或从疏水相变到亲水相，有助于释放载体内的药物。特别受关注的是含se聚合物，se是一种对人体至关重要的元素，在防护细胞免受氧化伤害方面扮演关键角色。人体中se的缺乏可能会导致克山病和抑郁症。由于se具有较高的原子序数和较低的电负性，含se聚合物的化学键能低于含硫聚合物(c-se键244kj/mol，se-se键172kj/mol，c-s键272kj/mol，s-s键240kj/mol)。含se聚合物对ros有更高的敏感性，它们可以氧化成se和硒酮，通过类似硫醚的机制，从疏水性转变为亲水性。二硒键氧化成硒酸后，可还原成硒醇，最终断裂，类似二硫键的反应机理。含se聚合物与含硫聚合物相比，对氧化剂的敏感性更高，适用于ros浓度较低的环境。长期以来，对合成含se聚合物的兴趣受到限制，因为se化物和二硒键在氧气存在下不稳定，且聚合物溶解度差。然而，2010年xu和zhang等人的一项开创性研究表明，通过在二元醇结构中引入双硒化物基团，可以提高其溶解度。他们以甲苯二异氰酸酯和含二硒化物的二元醇为原料，通过逐步聚合合成了两亲性二硒化物聚氨酯。自那时起，已经开发出许多含se共聚物，催生了大量ros响应型聚合物载体的合成。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供了一个可强化rt疗效的静脉注射型ovs的制备和应用，本发明开发一种适于静脉注射的“隐形”ovs(ad@pei-sese-peg，简称ad@pssp)，来协同rt。pei-sese-peg修饰带负电荷的ovs来抵抗中和抗体延长血液循环。当循环到肿瘤周围遇到rt后产生的ros时，ad@pssp中的se-se键断裂，脱落peg，恢复ovs的感染能力。此外，去peg化的pei可能通过静电相互作用强化ovs感染肿瘤细胞的能力。此外，我们观察到ovs可以减弱chek1-cdk通路的激活，从而增强放疗后的dna损伤。最后，ad-pei作为原位肿瘤疫苗载体，捕获rt后肿瘤抗原并将其递送到树突状细胞，产生抗原特异性免疫反应，有效消融远处肿瘤，并伴有持久的免疫记忆。
2、本发明所述的ovs修饰策略有望为涉及ovs联合rt的临床试验以及随后的临床部署奠定基础。且该ovs还具有生物相容性好、稳定性强、安全性高、生物利用度高等特点。
3、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
4、本发明提供一种可强化rt疗效的静脉注射型溶瘤病毒(ovs)-ad@pssp。
5、所述的溶瘤病毒优选为表达端粒酶(telomerase,tert)启动子和ad5增强子的基因工程化溶瘤腺病毒ad11。
6、所述的溶瘤病毒修饰基团为聚乙烯亚胺-二硒烯酸-聚乙二醇(polyethylenimine-diselenide-polyethylene glycol,pei-sese-peg，pssp)
7、本发明提供所述的ad@pssp的制备方法，包括：
8、将ovs与过量的pei-sese-peg在常温下孵育，然后通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，在超滤管内再次加入pbs重悬后，得到ad@pssp。
9、优选地，ad@pssp的制备方法为：将pei-sese-peg溶液与ad进行混合，然后置于室温环境下孵化，促进两者之间的充分结合。然后，通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，采用碘化钡对peg染色，确定反应最大制剂量(peg条带没有明显增宽增深)。
10、其中，按溶质个数与病毒粒子数比，ad11：pei-sese-peg(1.6×106/vp)。
11、优选地，pei-sese-peg，peg的分子量为20kda，我们的预实验和相关文献报道了peg化ad对中和抗体和巨噬细胞吞噬的抵抗能力随着peg分子量的增加而提高，在20kda时达到最高。
12、优选地，在超离管中，采用的低速离心转数为5000-10000rpm，离心5-10min；
13、优选地，所用滤膜孔径为0.45μm和0.22μm；
14、优选地，所用超滤管的截留分子量为50-100kda；
15、优选为，所述的ad@pssp需要在放入-80℃保存备用。
16、本发明制备的ad@pssp的粒径为133-138nm，分散指数pdi为0.21-0.25，粒径较均一(pdi＜0.3)，该范围内的纳米颗粒稳定，具有淋巴结富集作用，并且有利于抗原递呈细胞摄取，可以提高抗原和佐剂的靶向性和生物利用度。
17、所述的pei-sese-peg的水溶液由pei-sese-peg粉末与pbs在水中反应制备得到，具体步骤为：pei-sese-peg粉末与pbs以1-10mg/ml的比例混合均匀，得到pei-sese-peg溶液。
18、所述的pei-sese-peg的水溶液的制备在室温下进行，搅拌时间大于等于30mins，得到的pei-sese-peg水溶液，并在4℃下保存；
19、优选地，孵育为：将具有pei-sese-peg的水溶液与ad混合均匀后，在室温超声下处理；其中，所述的超声时间为30-60min，室温为20-25℃。
20、进一步的，超声功率为3～5w。
21、本发明提供所述可强化rt疗效的静脉注射型溶瘤病毒在制备治疗恶性实体瘤疾病药物中的应用。
22、本发明提供一种药物组合物，包括所述可强化rt疗效的静脉注射型溶瘤病毒以及药学中可接受的辅料。
23、本发明提供上述药物组合物在制备治疗恶性实体瘤疾病药物中的应用。
24、一种联合治疗方法，包括上述ad@pssp和rt；
25、优选地，rt单次剂量2gy以上。
26、进一步地，上述的应用为ad@pssp作为药物和rt协同治疗恶性实体瘤疾病。
27、更进一步地，所述的应用为：静脉注射ad@pssp与局部rt同时进行治疗恶性实体瘤疾病。
28、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
29、本专利成功地实现了将pssp与ad表面通过静电作用键合，制备了ad@pssp纳米颗粒。与单纯的ad或ad-pei相比，通过静脉注射ad@pssp能够显著延长其在血液中的循环时间并提高安全性。在接受放疗治疗并产生ros的肿瘤部位，ad@pssp能够有效释放ad-pei。相比于单独释放的ad，ad-pei在感染能力上得到了增强，并能够捕获由放疗产生的内源性肿瘤抗原，从而大幅增强了放疗后的肿瘤dna损伤程度和抗原特异性免疫反应。因此，ad@pssp不仅有效提升了放疗对全身肿瘤生长的抑制效果，还能激活持久的免疫记忆，有助于抑制术后肿瘤的复发。
30、这一专利为癌症的综合治疗提供了新的思路，并为实现癌症的长期控制和治愈带来了新的希望。通过结合放疗和免疫治疗策略，ad@pssp展现出了在癌症治疗中的巨大潜力，有望成为一种有效的抗肿瘤治疗方案。未来，这项专利为开展基于此专利的临床实验和进一步的临床应用提供了重要的支持。通过进一步优化和改良ad@pssp的制备方法和使用条件，我们有望将其推向临床应用，从而为癌症患者提供更加个体化和有效的治疗选择。
1.一种可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒，其特征在于，所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒表达端粒酶启动子和ad5增强子的基因工程化溶瘤腺病毒ad11。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述的溶瘤病毒修饰基团为聚乙烯亚胺-二硒烯酸-聚乙二醇。
3.权利要求1-2任一项所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，将ovs与过量的pei-sese-peg在常温下孵育，然后通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，在超滤管内再次加入pbs重悬后，得到所述可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒。
4.根据权利要求3所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，将pei-sese-peg溶液与ad进行混合，然后置于室温环境下孵化，促进两者之间的充分结合。然后，通过滤膜和超滤管去除没有反应的活性基团，采用碘化钡对peg染色，确定反应最大制剂量；其中，按溶质个数与病毒粒子数比，ad11：pei-sese-peg(1.6×106/vp)。
5.根据权利要求3所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，所述的pei-sese-peg中peg的分子量为20kda；在超离管中，采用的低速离心转数为5000-10000rpm，离心5-10min；所用滤膜孔径为0.45μm和0.22μm；和/或，所用超滤管的截留分子量为50-100kda。
6.根据权利要求3所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，所述的孵育为：将具有pei-sese-peg的水溶液与ad混合均匀后，在室温超声下处理；其中，所述的超声时间为30-60min，室温为20-25℃；所述的pei-sese-peg的水溶液由pei-sese-peg粉末与pbs在水中反应制备得到，具体步骤为：pei-sese-peg粉末与pbs以1-10mg/ml的比例混合均匀，在水中进行反应。
7.根据权利要求1-2任一项所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒，其特征在于，所述可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒的粒径为133-138nm，分散指数pdi为0.21-0.25。
8.权利要求1-2任一项所述的可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒在制备治疗恶性实体瘤疾病药物中的应用。
9.一种药物组合物，包括权利要求1-2任一项所述可强化放疗疗效的静脉注射型溶瘤病毒以及药学中可接受的辅料。
10.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗恶性实体瘤疾病药物中的应用。
