本发明属于基因工程，具体涉及病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用。
背景技术：
1、随着分子生物学技术的进步，特别是基因工程技术的发展，恶性肿瘤的基因治疗成为人们研究的热点。目前，全球共有600多项基因治疗方案获准进入临床试验，有些治疗方案已获得了一定的疗效，初步显示了基因治疗的前景。将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体结合，通过后者介导，将目的基因导入靶细胞并表达，才能达到真正的临床治疗效果。因此，构建治疗基因与基因载体的融合序列是实现基因治疗的关键。
2、缺乏特异性、靶向性及高效性的基因转移载体一直是肿瘤基因治疗的一个难题。目前，用于基因治疗研究的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体等。腺病毒载体是常用的基因载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片段、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，既能感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点。但也存在不足之处，一是感染缺乏特异性，二是具有免疫原性。
3、研究表明，腺病毒载体e1或e3缺失区携带外源性基因时，可以实现目的基因的较长时间的表达，且可降低其免疫原性；逆转录病毒载体能携带外源性基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因稳定持久的表达，但逆转录病毒体外繁殖滴度低、转染效率低，只感染分裂期细胞。对染色体的随机整合，有致癌的危险性；其他可用于基因转移的病毒载体和非病毒载体均存在不同的利弊。
4、因此，有必要提出病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，以至少部分地解决现有技术中存在的问题。
5、本背景技术所公开的上述信息仅仅用于增加对本发明背景技术的理解，因此，其可能包括不构成本领域普通技术人员已知的现有技术。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，利用腺病毒载体与人肿瘤抑制基因来构建重组体在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
4、优选的，所述其融合序列为：
5、腺病毒基因组序列右侧-atgtttaccgccacactcgcagggtctgca cctggtgcgggtctcatcgtacctcagcaccttccagatc,tctgacatg cgatgtcgactcgactgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgtatctgaggggactagggtgtgtttaggcgaaaagcggggcttcggttgtacgcggttaggagtcccctcaggatatagtagtttcgcttttgcatagggagggggaaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgccatttgaccattcaccacattggtgtgcacctccaagcttggtaccgagctcggatcccgs23ctagagccaccctccagggagcaggtagctgctgggctccggggaca ctttgcgttcgggctgggagcgtctttccacgacggtgacacgcttccc tggattggcagccagactgctttccgggtcactgcc6satggaggagccg cagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaaccttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccacccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtctggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgcccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccctgggcctgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagactgaigcattctccacttcttgttccccactgacagcctcccacccccatctctccctcccctgccattttgggttttgggtctttgaacccttgcttgcaataggtgtgcgtcagaagcacccaggacttccatttgctttgtcccggggctccactgaacaagttggcctgcactggtgttttgttgtggggaggaggatggggagtaggacataccagcttagattttaaggtttttactgtgagggatgtttgggagatgtaagaaatgttcttgcagttaagggttagtttacaatcagccacattctaggtaggggccacttcaccgtactaaccagggaagctctccctcactgttgaattttctctaacttcaaggcccatatctgtgaaatgctggatttgccctacctcggaatgctggcatttgcacctacctcacagagtgcattgtgagggttaatgaaataatgtacatctggccttgaaaccaccttttattacatggggtctagcgggatccactagtaacgccgccagtgtgctggaattctgcagatatccatcacactggcggccgctcgagcatgcatctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgccgtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcgagggggatccccacgctagagcta3gactataataataaaacgccaactttgacccggaacgcggaaa acacctgagaaaaacacctgggcgagtctccacctaaacggtcaaagtccccgcggccctagacaaatatta2848-腺病毒基因组序列左侧
6、优选的，所述重组腺病毒的扩增：在25cm2培养瓶内培养腺病毒细胞，待丰度达到70％～80％时，弃培养液，加3ml d-hanks溶液洗去培养瓶内残余血清，按5pfu/细胞加入1ml用无血清dmem稀释的腺病毒稀释液，放入37℃培养箱培养，每隔10min轻轻摇晃培养瓶，以保持病毒被均匀吸附，1h后弃病毒稀释液，加3ml d-hanks溶液洗去培养瓶内未吸附的病毒颗粒，补加5ml无血清的dmem，置34℃培养箱继续培养至细胞完全病变时收获。
7、优选的，所述腺病毒的纯化：将收获的细胞悬液反复冻融3次，4000g 4℃离心10min，收集上清液，用bdadeno-xtm腺病毒纯化试剂盒(cat.nos.631532)纯化、分装后保存于-70℃。
8、优选的，所述辐射诱导与重组腺病毒载体转染：在25cm2瓶内接种1x106个ht-29细胞，24h后在室温下用0.5，1.0，2.0gy(0.2gy/min)60coγ射线照射细胞，弃培养液，加3ml d-hanks溶液洗去培养瓶内残余血清，在辐照后1h内按40moi和80moi加入1ml重组腺病毒系数液，置37℃培养，每隔10min轻轻摇晃1次，1h后弃病毒稀释液，加3mld-hanks溶液洗去培养瓶内未吸附的病毒颗粒，补加10ml含10％血清的dmem，置37℃培养箱培养、传代。
9、优选的，所述细胞凋亡的测定：用胰酶消化收集细胞悬液，离心弃上清，用pbs洗涤2次，弃上清，将沉淀悬起，加入70％的乙醇振荡混匀后室温固定30min，离心弃上清，将沉淀悬起，用pbs洗涤2次，离心弃上清，将沉淀悬起，加入100μl(5μg/ml碘化丙啶(pi)、10ku/ml，0.005％triton-100)的荧光染料，振荡混匀后室温避光染色30min，离心弃上清，将沉淀悬起，用pbs洗涤2次，加入1ml pbs制成细胞悬液，用bdfcm分析。
10、优选的，所述人肿瘤抑制基因蛋白表达的检测：胰酶消化收集细胞，用冷pbs洗两次，将沉淀悬起，加4％甲醛室温固定30min，离心弃上清，将沉淀振荡悬起后加入0.5ml含有质量分数为0.1％tween-20和0.5％bsa的pbs，充分混匀后室温孵育30min，用冷pbs洗涤2次，离心弃上清，将沉淀悬起，加100μl 1：10o稀释的鼠抗人肿瘤抑制基因mab-1，室温孵育30min，用冷pbs洗2次，离心弃上清后将沉淀悬起，加100μl 1：200稀释的fitc标记的羊抗鼠igg，室温避光孵育30min后上机分析。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
12、本发明利用人类肿瘤抑制基因能抑制多种肿瘤细胞生长的特点，将其克隆到腺病毒，进而有效地将人肿瘤抑制基因导入肿瘤组织，表达出对应的蛋白来抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤细胞出现生长阻滞或凋亡，从而达到抑制肿瘤的目的；重组体利用腺病毒携带人类肿瘤抑制基因直接在肿瘤细胞中表达，从而解决了由于人肿瘤抑制基因蛋白表达不稳定、无法用基因工程的方法体外制备成重组基因工程产品的问题，这种方法实现将外源人肿瘤抑制基因转移并在病人肿瘤组织内高效表达而达到治疗目的，使得增生性疾病的基因治疗成为现实。
13、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
1.病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于，利用腺病毒载体与人肿瘤抑制基因来构建重组体在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于：所述重组体包括以下核苷酸序列：
3.根据权利要求1所述的病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于：所述的人肿瘤抑制细胞的基因在上游采用任一真核细胞启动子、原核细胞启动子或病毒启动子，下游采用任何真核基因的多聚腺嘌呤核苷酸。
4.根据权利要求1所述的病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于：所述该重组体在任何原核细胞中以同源重组的方式获得。
5.根据权利要求1所述的病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于：所述的重组体用于制备治疗各种恶性肿瘤的药物。
6.根据权利要求1所述的病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，其特征在于：所述的重组体用于制备预防肿瘤的发生和手术切除后的肿瘤再生的药物。
