本发明涉及生物，尤其涉及一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法及应用。
背景技术：
1、犬瘟热病毒是一种高度传染性病毒，会导致犬只患上严重疾病并破坏其免疫系统，引发其他病原菌的继发感染，对犬只健康和社会经济造成重大威胁。定期接种犬瘟热疫苗是有效预防犬瘟热及其继发感染的有效措施。中和抗体的效价是评估犬瘟热疫苗有效性和免疫保护能力的重要指标。中和抗体与犬瘟热病毒结合后，形成病毒-抗体复合物，阻止病毒与细胞受体结合，从而阻止病毒进入细胞。中和抗体的结合也可能激活免疫反应，引发炎症反应并诱导其他免疫细胞参与，有助于清除感染的病毒。中和抗体能使病毒失去感染能力，并标记病毒颗粒，使其易于巨噬细胞或其他免疫细胞摄取和清除。因此，中和抗体检测方法的准确性和灵敏度对于犬瘟热疫苗的研究和监管具有重要意义。
2、当前犬瘟热疫苗中和抗体检测存在的缺点和问题主要包括以下几点：
3、1.方法缺乏标准化：目前，犬瘟热疫苗中和抗体检测方法缺乏统一的标准化，不同实验室可能采用不同的试剂和操作流程，导致结果的可比性和准确性有所差异。
4、2.灵敏度低：传统的通过细胞病变效应检测中和抗体的方法可能对低效价抗体反应不敏感，具有很大的人为误差，从而低估了抗体水平。
5、3.特异性差：某些非特异性反应也可能导致误诊。
6、综上所述，如何设计一种能够检测抗体，且确保结果的特异性和灵敏性的检测方法，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明实施例的主要目的在于提出一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法及应用，旨在设计一种能够检测抗体，且确保结果的特异性和灵敏性的检测方法。
2、本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，包括以下步骤：
3、1)病毒与血清共孵育：
4、将血清与等体积的犬瘟热病毒混合均匀后于34℃～37℃共孵育1～2h，形成病毒与抗体的复合物；
5、2)病毒-血清混合物感染细胞：
6、将病毒与抗体的复合物加入孔板中，在34～37℃共孵育1～2h，以使病毒感染细胞；
7、将病毒-血清混合物废弃，用培养基洗涤细胞2次；
8、将培养基加入细胞中，并将细胞放入37℃的培养箱中继续培养24h；
9、3)通过免疫荧光或酶联免疫吸附法判定中和抗体效价：
10、用缓冲液洗涤细胞2次，加入固定剂；
11、将固定剂废弃，用缓冲液洗涤两次，加入通透剂进行透明化处理；
12、加入犬瘟热病毒的核蛋白抗体进行免疫荧光和/或酶联免疫吸附法检测。
13、进一步地，所述将血清与等体积的犬瘟热病毒混合均匀后于34℃～37℃共孵育1～2h，形成病毒与抗体的复合物的步骤中，
14、所述犬瘟热病毒的滴度为200×tcid50。
15、进一步地，所述用缓冲液洗涤细胞2次，加入固定剂的步骤中，
16、所述孔板为预先贴壁好的vero或mdck细胞96孔板；细胞密度为70％～90％。
17、进一步地，所述将固定剂废弃，用缓冲液洗涤两次，加入通透剂进行透明化处理的步骤中，
18、所述固定剂为4％多聚甲醛，室温固定10min～20min；或所述固定剂为丙酮，4℃固定5min～10min。
19、进一步地，所述将固定剂废弃，用缓冲液洗涤两次，加入通透剂进行透明化处理的步骤中，加入通透剂进行透明化处理包括0.1％～2％ triton x-100或0.1％～1％tween20室温穿膜5min～10min。
20、进一步地，所述加入犬瘟热病毒的核蛋白抗体进行免疫荧光检测的步骤中，一抗为抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体，二抗为荧光标记的二抗；或一抗为荧光标记的抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体。
21、进一步地，所述加入犬瘟热病毒的核蛋白抗体进行酶联免疫吸附法检测的步骤中，一抗为抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体，二抗为碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的二抗；或一抗为碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体。
22、本发明还提出一种将上述犬瘟热疫苗中和抗体检测方法在制备试剂盒中的应用。
23、本发明还提出一种将上述犬瘟热疫苗中和抗体检测方法在制备试纸条中的应用。
24、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
25、第一、本发明提供了一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法。通过制定统一的操作流程和质量控制标准，该方法可以保证犬瘟热疫苗中和抗体检测结果的可比性和准确性；采用更敏感的检测方法，免疫荧光或酶联免疫吸附法，可以提高对低效价抗体的检测效果，并减少人为误差的影响；引入特异性的抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体，可以避免与其他病原菌产生交叉反应，提高检测结果的特异性；另外，该方法的全程耗时不超过36h，这有效降低了成本和时间消耗。这种方法克服了传统方法中的人为误差、特异性差、灵敏度低和耗时长的问题，为犬瘟热的预防和控制提供了有效的工具。
26、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
27、本发明提供了一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法。该方法通过制定统一的操作流程和质量控制标准，引入特异性的抗犬瘟热病毒核蛋白的检测抗体，并采用灵敏度更高的免疫荧光或酶联免疫吸附法来确定血清内的犬瘟热病毒中和抗体水平。这一方法可有效地避免误判和漏诊的问题，并具有准确、有效、高特异性和高灵敏度的特点。
28、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
29、(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
30、本发明提供了一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，可以准确评估狗体内的犬瘟热病毒中和抗体水平，帮助兽医确定狗的免疫状况，从而指导预防和控制犬瘟热的工作；具备高特异性和高灵敏度，能够有效避免误判和漏诊的问题，提供可靠的检测结果；可以为兽药研究、开发和监管提供可靠的检测手段，帮助评估疫苗的效果和质量。本发明的技术方案具有广泛的应用前景和商业价值，在犬瘟热的预防和控制、兽药研究和开发以及疫苗监管等领域具有重要意义。
31、(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
32、本发明提供了一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法与应用，制定了统一的操作流程和质量控制标准，确保了中和抗体检测结果的可比性和准确性；采用免疫荧光、酶联免疫吸附法和抗犬瘟热病毒核蛋白的检测抗体确保了结果的特异性和灵敏性，这解决了传统方法中存在的问题。
33、(3)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
34、本技术方案相比传统的中和抗体检测方法确实克服了人为误差、特异性差、灵敏度低和耗时长的问题。
1.一种犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述将血清与等体积的犬瘟热病毒混合均匀后于34℃～37℃共孵育1～2h，形成病毒与抗体的复合物的步骤中，
3.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述用缓冲液洗涤细胞2次，加入固定剂的步骤中，
4.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述将固定剂废弃，用缓冲液洗涤两次，加入通透剂进行透明化处理的步骤中，
5.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述将固定剂废弃，用缓冲液洗涤两次，加入通透剂进行透明化处理的步骤中，加入通透剂进行透明化处理包括0.1％～2％triton x-100或0.1％～1％tween20室温穿膜5min～10min。
6.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述加入犬瘟热病毒的核蛋白抗体进行免疫荧光检测的步骤中，一抗为抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体，二抗为荧光标记的二抗；或一抗为荧光标记的抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体。
7.根据权利要求1所述的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法，其特征在于，所述加入犬瘟热病毒的核蛋白抗体进行酶联免疫吸附法检测的步骤中，一抗为抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体，二抗为碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的二抗；或一抗为碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗犬瘟热病毒核蛋白的抗体。
8.如权利要求1至7中任一项的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法在制备试剂盒中的应用。
9.如权利要求1至7中任一项的犬瘟热疫苗中和抗体检测方法在制备试纸条中的应用。
