本发明涉及微生物基因检测，具体涉及一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法。
背景技术：
1、病原微生物检测技术主要分为传统培养法、免疫学法和分子生物学法。传统检测主要分为三类：涂片镜检、分离培养与生化反应、组织细胞培养；免疫学法主要包括酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫荧光法等；基因检测主要以核酸分子杂交技术、pcr技术和基因芯片技术为主。
2、现有的基因检测法存在一定的缺陷：基于培养的传统检测方法主要适用在细菌和真菌上，菌种培养周期较长，依赖操作人员的培养技术，且无法检测生长在培养基上的病原体，培养过程较容受到污染，结果鉴定精度低，易造成假阳性。免疫学法检测病原微生物需要特定的试剂和设备，且不能检测所有病原体。基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、pcr反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测方法均需要专业的微生物领域知识、无法实现高通量检测。mngs技术对于胞内菌、真菌两类微生物检测灵敏度较低，一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液、胸腹水等，宿主基因组污染比例一般在80％以上，这就导致测到的微生物序列非常少，很大一部分数据都无法有效利用，对于rna病毒样本，由于rna需要经过逆转录过程，且易降解，对rna病毒检测存在一定的难度。目前mngs单项检测(dna或rna)，终端收费相对较昂贵，如非危难、重症患者，一般难以接收检测。
技术实现思路
1、本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，它使用单端多重pcr结合ngs技术对病原微生物进行检测，单端多重pcr能同时扩增多个片段，在数个小时内即可完成多种病原体的建库，样本起始量低，高效且操作步骤简单，扩增子数量可以达到一千重以上，均一性较佳，即使是质量较差的样本也能够在短时间内完成建库；单端特异性靶向扩增可以极大程度避免人源背景的干扰，降低测序成本，提高检测效率，同时精准检测panel内全部病原体；四种防污染umi接头，高效监控样本间污染情况；双端index建库，可以很好的解决index hopping问题，从而实现样本精准拆分；还增加了内参引物把控实验流程。
2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，它包括以下步骤：
3、步骤一：引物设计，从ncbi下载参考基因组，并滑动产生kmer序列，使用blast比对到nt参考库，过滤非特异kmer，使用mfeprimer筛选合适的引物序列，从每个物种挑选出一对内外侧引物序列；使用内侧引物在外侧引物基础上进行pcr扩增，增强特异性，再根据自行设计的引物序列，合成引物；
4、步骤二：cdna一链合成，将1st strand buffer取出，解冻后颠倒混匀，在pcr管中加入6μl混匀后的1st strand buffer、17μl的rna、2μl的1st strand enzyme mix2配制成反应液，使用移液器吸打混匀，瞬时离心，再将反应液放置于pcr仪上，运行程序，得到产物a；
5、步骤三：cdna二链合成，将2nd strand buffer取出解冻后，颠倒混匀，在pcr管中加入20μl混匀后的2nd strand buffer、25μl的产物a、5μl的2nd strand enzyme mix2配制成反应液，使用移液器吸打混匀，瞬时离心，再将反应液放置于pcr仪上，运行程序，得到产物b；
6、步骤四：逆转录后纯化，取90μl磁珠于管中，加入产物b，混匀后室温静置10min，再瞬时离心，置于磁力架上静置5min，待液体澄清后弃上清液，再加入180μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，待溶液澄清后弃上清，重复两次，盖上管盖，瞬时离心，将残留乙醇离心至管底，将八连管置于磁力架上，用10μl移液器吸去残余乙醇，室温静置3min，将管从磁力架上取下，加入53μl的nuclease-free water，吸打或涡旋混匀，室温静置2min，再将管置于磁力架上3min，待溶液澄清，吸取50μl上清液，转移到新的pcr管或八连管中，得到dna与cdna混合物；
7、步骤五：片段化，将fea enzyme mix v3取出，解冻并混匀、短暂离心收集至管底，置于冰上备用，将灭菌pcr管置于冰上，取10μl的fea enzyme mix v3和dna与cdna混合物于灭菌pcr管中，混匀、离心，将反应液收集至管底，再将灭菌pcr管置于pcr仪中，运行程序，得到产物c；
8、步骤六：接头连接，将rapid ligation buffer v3、rapid dna ligase v3分别取出于管中，解冻后混匀，短暂离心收集至管底，置于冰上备用，将pcr管放置于冰上，取30μl的rapid ligation buffer v3、5μl的rapid dna ligase v3、5μl的adapter、产物c于pcr管中，混匀后，离心将反应液收集至管底，再将灭菌pcr管置于pcr仪中，运行程序，得到产物d；
9、步骤七：连接后纯化，取80μl磁珠于八连管中，加入产物d，混匀后，室温静置5min，瞬时离心，置于磁力架上静置2-6min，待液体澄清后弃上清液，再加入180μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，待溶液澄清后弃上清，重复两次，盖上管盖，瞬时离心，将残留乙醇离心至管底，将八连管置于磁力架上，用10μl移液器吸去残余乙醇，室温静置3min，再将管从磁力架上取下，加入22μl的nuclease-free water，吸打或涡旋混匀，室温静置2min，再将管置于磁力架上3min，待溶液澄清，吸取20μl上清液，转移到新的pcr管或八连管中，得到20μl的dna；
10、步骤八：特异性扩增，室温解冻所需试剂，上下颠倒混匀备用，在冰上放置pcr管，在管中加入20μl的dna、2μl的特异性引物、2μl的通用引物、6μl的5×vahts rt multi-pcrmix，混匀后瞬时离心，将pcr管放置于pcr仪上，运行程序，得到产物e；
11、步骤九：特异性扩增后纯化，取50μl磁珠于八连管中，加入全部产物e，混匀后，室温静置5min，瞬时离心，置于磁力架上静置2-6min，待液体澄清后弃上清液，再加入180μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，待溶液澄清后弃上清，重复两次，用10μl移液器吸去残余乙醇，室温静置3min，加入20μl的nuclease-free water，将八连管从磁力架取下，吸打或涡旋混匀，室温静置2min，瞬时离心，再将八连管置于磁力架上，待溶液澄清，吸取16μl上清液，转移到新的pcr管或八连管中，标记为产物f；
12、步骤十：postpcr扩增，将pcr管放置于冰上，在pcr管中加入产物f、4μ的lindex、20μl的vahts hifi amplification mix，混匀后瞬时离心，将pcr管放置于pcr仪上，运行程序，得到产物m；
13、步骤十一：postpcr扩增后纯化，取36μl磁珠于八连管中，加入全部产物m，混匀后，室温静置5min，瞬时离心，置于磁力架上静置3min，待液体澄清后弃上清液，再加入180μl新鲜配制的80％乙醇，静置30s，待溶液澄清后弃上清，重复两次，用10μl移液器吸去残余乙醇，室温静置3min，加入35μl的nuclease-free water，将八连管从磁力架取下，吸打或涡旋混匀，室温静置2min，瞬时离心，再将八连管置于磁力架上2min，待溶液澄清，吸取32μl上清液，转移到新1.5ml管中，标记为产物n；测量产物n并记录文库浓度和片段大小；通过测序仪测序。
14、所述1st strand buffer、2nd strand buffer、rapid ligation buffer v3、rapid dna ligase v3均保存与-20℃下。
15、所述步骤二中的pcr仪的程序为：热盖105℃，25℃运行10min，42℃运行10min，70℃运行15min，最终保持在4℃。
16、所述步骤三中的pcr仪的程序为：无热盖，16℃运行60min，最终保持在4℃。
17、所述步骤五中的pcr仪的程序为：热盖105℃，30℃运行5min，72℃运行5min，最终保持在4℃。
18、所述步骤六中的pcr仪的程序为：无热盖，20℃运行15min，最终保持在4℃。
19、所述步骤七中的pcr仪的程序为：热盖105℃，95℃运行3min，95℃运行30s，60℃运行1min，72℃运行1min，72℃运行3min，最终保持在4℃。
20、所述步骤十中的pcr仪的程序为：热盖105℃，98℃运行3min，98℃运行30s，60℃运行1min，72℃运行30s，72℃运行1min，最终保持在4℃。
21、本发明的工作原理：本技术使用超多重单端pcr配合ngs测序，对dna和rna样本共同建库，是针对病原微生物设计的tngs体系。本技术首先对片段化的不同样本末端分别加入4种umi接头(序列信息详见umi信息表)，umi接头能够识别出每个dna分子，避免pcr和测序过程中的错误扩增，同时可以通过生信分析对下机数据进行过滤，相比于传统的随机umi，得到的测序结果更准确；其次对目标区域进行两轮特异性的pcr扩增，第一轮扩增通过outer引物和通用引物对连接产物的目标区域进行特异性富集来获得第一轮pcr产物，第二轮特异性pcr扩增通过inner引物和通用引物对第一轮产物的目标区域的进行反应富集，本技术通过对样本进行两轮特异性pcr后上机测序，可有效检出多种病原微生物，且具有良好的特异性，该技术首次应用于病原微生物的ngs测序；在outer引物和inner引物中加入5％的人源内参基因，不同样本中的微生物含量不同，内参基因在每个样本中的表达量不受影响，选择稳定表达的人源vcp和gpi基因作为内参来归一化数据，保证实验流程可控，确保测序结果准确和可靠。
22、采用上述技术方案后，本发明有益效果为：
23、1.使用超高重pcr技术和二代高通量测序技术对病原微生物进行检测，投入10ng样本即可进行建库；
24、2.多重单端引物可以直接混合使用，不需要调整单引物的浓度；
25、3.rna样本和dna样本可以共同建库，简化实验操作；
26、4.实验操作简便，7小时内可以完成全流程操作；
27、5.4种防污染的umi接头，去除外源dna序列，能对样本间的污染情况高效监测；
28、6.使用单端多重pcr不易产生气溶胶污染，降低检测结果假阳性的概率；
29、7.双端index可以进行index之间正交组合，丰富index多样性，增加每条lane的最终混库数量，有效降低index hopping效应，对数据精准拆分，提高测序准确性；
30、8.有完整的实验体系，全流程可控。
1.一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：它包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述1st strand buffer、2nd strand buffer、rapid ligation buffer v3、rapid dnaligase v3均保存与-20℃下。
3.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤二中的pcr仪的程序为：热盖105℃，25℃运行10min，42℃运行10min，70℃运行15min，最终保持在4℃。
4.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤三中的pcr仪的程序为：无热盖，16℃运行60min，最终保持在4℃。
5.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤五中的pcr仪的程序为：热盖105℃，30℃运行5min，72℃运行5min，最终保持在4℃。
6.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤六中的pcr仪的程序为：无热盖，20℃运行15min，最终保持在4℃。
7.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤七中的pcr仪的程序为：热盖105℃，95℃运行3min，95℃运行30s，60℃运行1min，72℃运行1min，72℃运行3min，最终保持在4℃。
8.根据权利要求1所述的一种用于病原微生物的单端多重pcr建库方法，其特征在于：所述步骤十中的pcr仪的程序为：热盖105℃，98℃运行3min，98℃运行30s，60℃运行1min，72℃运行30s，72℃运行1min，最终保持在4℃。
