本发明广义上涉及微生物控制领域，如工业或临床来源样品的微生物控制。更具体地，本发明涉及一种反应培养基以及用于检测、鉴定、计数和/或分离目标微生物的相关方法。
背景技术：
0、现有技术
1、对各种来源的样品进行微生物控制需要实施可以检测微生物的技术，例如出于鉴定和/或计数和/或生化表征目的，并且必须尽快获得结果。
2、在医学领域，有必要预测和诊断感染风险：诊断越快、越准确，对患者的管理就越有效，且传播的风险越低。对于兽医领域的动物健康，方法是类似的。
3、在农业食品领域，问题是相同的。然而，以下微生物之间是有区别的：
4、-致病微生物如产志贺毒素细菌(stec)、沙门氏菌(salmonella)、李斯特菌(listeria)、克罗诺杆菌(cronobacter)、芽孢杆菌(bacillus)、葡萄球菌(staphylococcus)，其检测适用于起始原料、中间产品和销售成品，
5、-非致病微生物，用作生产过程的质量指标，从起始原料到成品，贯穿整条链，
6、-技术上感兴趣的细菌，如发酵剂，
7、-作为污染标志的微生物。
8、对可疑污染(食品批次内)的快速和准确检测使得可以对其进行监测，从而可以快速采取纠正措施。
9、在技术上，主要困难之一是能够分离出感兴趣的细菌以便对其进行鉴定。一般来说，微生物分析是一个两步过程。第一步是检测阶段，可能涉及许多技术如培养基、免疫测定和分子生物学。随后，特别是在农产品领域，可能进入确认阶段，以确认所关注的病原体的存在并遵守该领域的现行标准。因此，确认步骤涉及额外的步骤，这里再次需要分离感兴趣的细菌。
10、因此，在产志贺毒素大肠杆菌(e.coli)(stec)的情况下，诊断依赖于使用选择性显色琼脂如smac(山梨醇麦康凯琼脂)、rmac(鼠李糖麦康凯琼脂)或rainbow agar o157，以选择某些细菌的生长并对感兴趣的菌株进行染色。然而，最终，如果不进行培养以使用pcr型分子生物学测试来分离和确认菌株的身份，这些琼脂中没有一种对stec具有足够的特异性。具体来说，它们的致病性涉及几种毒力基因的表达，特别是编码两种志贺毒素：stx1和stx2的stx1和stx2。这两种毒素通过抑制真核细胞中的蛋白合成而起作用，最终导致细胞凋亡。为了准确鉴定致病性stec，必须对基因stx1、stx2或eae(另一种毒力因子)进行pcr。因此，这些过程既费时又费力，并且在培养中没有系统地发现携带两种基因(stx和eae)的细菌。
11、免疫学方法也可用。大量测试可用于检测食品和/或环境样品中的大肠杆菌o157:h7。这些系统包括经典的微孔板elisa测试、一步法免疫学系统和全自动系统。
12、“一步法”免疫学方法由于其快速实施和简单性而在工业中得到广泛应用。其中许多系统是基于免疫色谱的原理。该装置由塑料支架、样品孔以及测试和控制窗口组成，所述塑料支架含有用大肠杆菌o157:h7(即o157和可能的h7)特异性抗体包被的金或乳胶颗粒浸渍的膜。测试窗口中出现彩色线表示阳性结果，表示食品中可能存在大肠杆菌o157。例如，可以提到“vip ehec”测试(biocontrol,montesson,france)，该测试可以在富集数小时后可视化给定样品是否被大肠杆菌o157污染。然而，这种方法不可能对样品中的大肠杆菌o157进行定位，也不可能确定其致病性。
13、elisa/elfa系统是免疫学方法，在富集阶段(通常持续24小时)后，在微孔板中2小时内提供结果。公司开发了基于技术的自动化elisa(elfa)试剂盒。在阳性测试的情况下，这些方法的缺点是不能直接分离出可疑菌落。因此，有必要培养样品以分离阳性菌落，并通过pcr确认这种细菌确实是导致测试呈阳性的细菌。
14、elisa方法也可用于检测非o157 stec，其主要基于检测志贺毒素的产生，可能是在富集步骤之后。其中一些方法使用针对stx毒素的单克隆或多克隆抗体，并使用碱性磷酸酶连接的抗体进行可视化。在可用的elisa试剂盒中，可以提到的是针对志贺毒素的“premier ehec”(meridian diagnostics inc.,usa)。还开发和销售了使用适合stx毒素检测的反向被动凝集测定(rpla)技术的试剂盒。该技术使用与志贺毒素相互作用的抗体包被的珠，在存在培养上清液的孔的底部产生弥散层。然后这些方法需要分离阳性菌落，随后进行确认步骤。
15、免疫磁性分离(ims)方法也适用于检测和分离属于五个主要stec血清群的菌株。它在液体培养基中进行，使用针对抗原o26、o111、o103和o145的抗体包被的磁珠。然而，通过这种方法分离的菌株必须确认stx基因的存在，才可以被视为stec菌株。
16、因此，亟需开发一种可靠和快速的方法来分离和鉴定目标细菌，特别是致病菌。
技术实现思路
1、本发明的第一个主题涉及一种胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离可能含有目标微生物的样品中的至少一种目标微生物，所述反应培养基包含目标微生物的组分或衍生自所述微生物的组分的至少一种特异性结合伴侣，所述至少一种特异性结合伴侣与至少一种纳米颗粒偶联以形成至少一种凝集缀合物。
2、用于检测目标微生物的组分是由所述微生物释放到反应培养基中的组分。它可以是所述目标微生物的成分，如脂多糖(lps)，或者是由目标微生物产生的组分，如毒素。
3、非常有利地，所述培养基因此可以在培养基上定位释放所述组分的目标菌落。这改进了目标微生物的检测，并且在微生物控制领域节省了非常宝贵的时间，特别是在确认步骤期间。
4、优选地，所述缀合物包含具有光学特性的胶体纳米颗粒。
5、有利地，根据本发明的培养基包含毒素诱导剂。因此，根据本发明的培养基提供检测产志贺毒素大肠杆菌(stec)菌株的非常有利的手段。
6、本发明的另一个主题涉及一种检测、鉴定、计数和/或分离可能含有目标微生物的样品中的目标微生物方法，包括以下步骤：
7、-将所述样品与根据本发明的反应培养基接触
8、-温育
9、-检测所述目标微生物的存在。
10、有利地，通过在反应培养基上的目标微生物周围出现晕轮来进行检测。
1.一种胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离可能含有目标微生物的样品中的至少一种目标微生物，所述培养基包含目标微生物的组分或衍生自所述微生物的组分的至少一种特异性结合伴侣，所述至少一种特异性结合伴侣与至少一种纳米颗粒偶联以形成至少一种凝集缀合物。
2.权利要求1的胶凝反应培养基，其特征在于它是一种微生物培养基。
3.权利要求1的胶凝反应培养基，其特征在于它是一种微生物可视化培养基。
4.前述权利要求中任一项的反应培养基，其特征在于所述结合伴侣选自抗体、适配体、噬菌体蛋白和引物。
5.前述权利要求中任一项的培养基，其特征在于所述纳米颗粒是具有光学特性的胶体纳米颗粒。
6.前述权利要求的培养基，其特征在于所述纳米颗粒选自金、银和铜。
7.前述权利要求中任一项的培养基，其特征在于所述纳米颗粒的大小在10至200nm之间，优选在20至90nm之间。
8.前述权利要求中任一项的培养基，其中所述反应培养基与琼脂培养基接触。
9.前述权利要求中任一项的培养基，其特征在于所述培养基包含衍生自所述微生物的组分的诱导剂。
10.权利要求9的培养基，其特征在于所述培养基包含毒素诱导剂。
11.权利要求10的培养基，其特征在于所述毒素诱导剂是抗生素。
12.权利要求11的培养基，其特征在于所述毒素诱导剂是浓度在0.005至0.030mg/l之间的环丙沙星。
13.权利要求11的培养基，其特征在于所述毒素诱导剂是浓度在0.10mg/l至0.50mg/l之间的丝裂霉素c。
14.前述权利要求中任一项的反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离至少一种目标微生物，所述目标微生物选自：大肠杆菌(escherichia coli)、产志贺毒素大肠杆菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)、假单胞菌、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)群、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)mssa、金黄色葡萄球菌mrsa、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)。
15.一种用于制备前述权利要求中任一项的反应培养基的诊断试剂盒，包含
16.权利要求1-15的反应培养基的制备，包括使凝集缀合物与胶凝培养基接触以形成所述反应培养基的步骤。
17.一种体外微生物培养方法，其中将样品中可能存在的微生物接种在权利要求1-14中任一项的培养基中或在所述培养基上。
18.权利要求1-14中任一项的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离大肠杆菌菌株，其包含对所述菌株的lps特异性的噬菌体蛋白，所述噬菌体蛋白与纳米颗粒偶联以形成凝集缀合物。
19.权利要求18的胶凝反应培养基，其特征在于lps特异性噬菌体蛋白的量使得可以覆盖至少一半纳米颗粒表面。
20.权利要求18或19的胶凝反应培养基，其特征在于所述纳米颗粒由金制成，大小在20至90nm之间，并且浓度在1010至1012纳米颗粒/ml反应培养基之间。
21.权利要求1-14中任一项的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离大肠杆菌菌株，其包含对所述菌株特异性的单克隆抗体，所述抗体与纳米颗粒偶联以形成凝集缀合物。
22.权利要求21的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离至少一种产志贺毒素大肠杆菌菌株，其包含至少一种毒素诱导剂，至少一种stx1特异性抗体和/或至少一种stx2特异性抗体，所述至少一种抗体与纳米颗粒偶联以形成凝集缀合物。
23.权利要求22的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离至少一种产志贺毒素大肠杆菌，其包含浓度在0.005至0.030mg/l之间的环丙沙星。
24.权利要求22的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离至少一种产志贺毒素大肠杆菌，其包含浓度在0.10mg/l至0.50mg/l之间的丝裂霉素c。
25.权利要求21-24中任一项的胶凝反应培养基，用于检测、鉴定、计数和/或分离至少一种产志贺毒素大肠杆菌，其特征在于所述纳米颗粒是金纳米颗粒，大小在20至90nm之间，并且浓度在1010至1012纳米颗粒/ml反应培养基之间。
26.一种检测、鉴定、计数和/或分离可能含有目标微生物的样品中的目标微生物的方法，包括以下步骤：
27.前述权利要求的方法，其中通过权利要求1-14或18-25中任一项的反应培养基上的目标微生物周围出现晕轮来进行检测。
