本发明涉及生物，特别是涉及一种单增李斯特菌的纳米抗体及其应用。
背景技术：
1、单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes，lm），简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性小杆菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌病的致病病原体。lm主要通过肠道感染，该菌在自然界广泛分布，耐盐，在低温条件下可繁殖，主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一。怀孕妇女、新生儿、老年人、免疫低下的患者易感此病，临床表现主要有流产、败血症、脑膜脑炎以及热性肠胃炎症状。
2、李斯特菌病的爆发于1981年首次被记录，已发现与食用各种受污染的食物有关，李斯特菌可存在于腐烂的蔬菜、污水、污泥、农产品和某些类型的食品中。人类感染主要是由于食用受污染的食物，如新鲜奶酪、煮熟和冷冻的家禽产品、猪肉产品、肉制品、热狗、熏鱼、蔬菜、海鲜、沙拉以及在冷藏温度下储存的即食食品（rte）。开发稳定、灵敏、可重复的单增李斯特菌检测方法尤为必要。
3、p60蛋白是由lm分泌的一种胞外蛋白，由iap基因编码，1989年首次被发现，是侵入宿主细胞所必需的胞外蛋白。由于p60蛋白可能是作为lm侵染哺乳动物细胞的辅助蛋白，故又称该蛋白为侵染辅助蛋白。编码p60蛋白的基因序列ｎ末端存在着一段典型的信号肽序列，这表明p60蛋白是一种分泌蛋白，具有正常细胞分裂所需的肽聚糖水解酶活性，在lm侵染宿主时分泌量较高，在侵染过程中有助于lm毒力的增强，p60蛋白在所有己分离出的李斯特菌中都能够分泌，这说明，单增李斯特菌p60蛋白可以应用于传统的免疫学检测中，以检测食品中的单增李斯特菌。
4、目前，针对单增李斯特菌的检测方法，涉及传统平板计数、免疫学检测、分子生物学检测、电化学检测、生物传感器、微流控系统等，展现了不同灵敏度和特异性。目前我国普遍将平板计数法作为检测的金标准，但由于其检测周期长，时效性差，步骤繁琐，需要反复增菌，常常因此错过最佳检测时间，从而给生产实践造成损失。免疫学检测方法的应用常依赖于抗原抗体结合，使得操作简便化，大大缩短了检测时间，对比于传统的pcr等分子生物学检测，免疫学方法特异性较高的同时，降低了假阳性概率，重复性好，易于标准化，基于此建立的新型检测手段目前已展现出良好的检测性能。
5、在羊驼、单峰驼等驼科以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼体内，存在一种天然缺失轻链的重链抗体（heavy-chain antibodies，hcabs)，其重链可变区，称为纳米抗体（nanobody，nbs）也称为单域抗体（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，vhh）。纳米抗体的分子质量仅为15kda，相对于传统的igg抗体，纳米抗体具有易于表达，易改造、稳定性好、特异性强、亲和力高等优点。最重要的是，纳米抗体能识别常规抗体无法识别的隐藏抗原表位。纳米抗体延伸的cdr1区和更长的cdr3区，使得其具有突出的抗原决定簇，可以深入折叠蛋白的缝隙，这种结构改变允许纳米抗体结合到抗原的表面和裂隙上，对抗原具有更好的识别能力。
6、纳米抗体实现的免疫测定可用于检测包括细菌和病毒在内的微生物。纳米抗体用于检测食品中的病原微生物已渐渐趋于成熟，纳米抗体必将成为未来免疫学检测强有力的工具，更重要的是，纳米抗体的应用将促进快速、灵敏和特异性检测方法的发展，可以显示出比现有免疫学检测方法更高的准确性和稳定性，并有利于简化操作和缩短检测时间，有望取代现阶段基于常规抗体所建立的elisa检测方法。
7、然而，目前针对于李斯特菌的免疫学检测手段，主要应用的为传统的单克隆抗体和多克隆抗体，但传统抗体分子质量大，稳定性低，成本高，生产制备需要免疫大量实验动物，不符合动物福利，应用于现有检测仍然无法满足生产实践的要求，因此，开发稳定性高、特异性强、亲和力高以及制备流程简易的新型抗体尤为必要。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种单增李斯特菌的纳米抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。该纳米抗体可以特异性识别单增李斯特菌，利用其建立的双抗夹心elisa法，特异性强，灵敏度高，检测限低，并且能够大大缩短检测时间。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供一种单增李斯特菌的纳米抗体，氨基酸序列如seq id no.3所示。
4、本发明还提供一种上述的纳米抗体的编码基因。
5、进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、本发明还提供一种重组表达载体，包括上述的编码基因。
7、本发明还提供一种重组宿主细胞，包括上述的重组表达载体。
8、本发明还提供上述的编码基因、重组表达载体或重组宿主细胞在制备上述的纳米抗体中的应用。
9、本发明还提供上述的纳米抗体在制备检测单增李斯特菌的elisa试剂盒中的应用。
10、进一步地，所述elisa试剂盒为双抗夹心elisa试剂盒。
11、本发明还提供一种双抗夹心elisa试剂盒，包括上述的纳米抗体。
12、进一步地，所述双抗夹心elisa试剂盒还包括酶标板、检测抗体、酶标二抗、洗涤液、显色液和/或终止液；
13、所述纳米抗体包被在所述酶标板中。
14、本发明公开了以下技术效果：
15、本发明用原核表达的单增李斯特菌的p60蛋白作为免疫原免疫羊驼，提取外周血淋巴细胞总rna，经反转录和两轮巢式pcr扩增vhh片段，将vhh片段与pcomb3xss载体经过酶切消化，连接后转化至tg1感受态细胞，利用噬菌体展示技术经过三轮淘选，成功筛选出一条抗单增李斯特菌p60蛋白的纳米抗体lmnb2e10。基于此构建原核重组表达载体pet28a-lmnb2e10，通过热激法转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中，经iptg诱导后，对重组蛋白进行亲和纯化，并通过western blot验证该重组蛋白为特异性识别单增李斯特菌p60蛋白的纳米抗体lmnb2e10，其特异性高，稳定性强，敏感性良好。基于纳米抗体lmnb2e10所建立的双抗夹心elisa法，检测限为1.0×104cfu/ml，具有灵敏度高的优势。
16、本发明利用纳米抗体lmnb2e10制备了一种夹心elisa试剂盒，利用该试剂盒进行单增李斯特菌检测，检测限可达1.0×104 cfu/ml，与其他食源性致病菌无交叉反应，特异性强，并大大缩短了检测时间。
1.一种单增李斯特菌的纳米抗体，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.一种如权利要求1所述纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种如权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4所述的重组宿主细胞在制备权利要求1所述的纳米抗体中的应用。
6.一种如权利要求1所述的纳米抗体在制备检测单增李斯特菌的elisa试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述elisa试剂盒为双抗夹心elisa试剂盒。
8.一种双抗夹心elisa试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的纳米抗体。
9.根据权利要求8所述的双抗夹心elisa试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心elisa试剂盒还包括酶标板、检测抗体、酶标二抗、洗涤液、显色液和/或终止液；
