本发明属于生物工程，具体的涉及一种crm197包涵体蛋白的变复性方法。
背景技术：
1、crm197（ cross reacting material,白喉毒素突变体）是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，它是野生型dt的核苷酸序列中由一个碱基g突变为a，从而导致了第52位氨基酸gly变为glu。从结构上看，crm197具有完整的dt功能结构。但试验表明，crm197不能对细胞产生毒性作用。
2、crm197不具有酶活性及毒性，但具有dt的免疫原性。因此，crm197作为一种蛋白载体与多糖耦联制备成多糖结合疫苗，已有相应的产品上市。
3、目前crm197一般采用溶原化的白喉杆菌分泌产生，该菌株经由β噬菌体感染含有编码dt的tox突变基因。该系统的优点是目的蛋白以分泌形式表达于胞外，杂蛋白含量低有利于纯化生产。缺点是白喉杆菌发酵条件严苛，且培养基成分复杂，价格昂贵。
4、采用大肠杆菌表达系统，具有生产周期短、成本低、外源dna易于导入、外援蛋白表达简易和能很快产生大量的目的蛋白等优点，是表达重组蛋白优先选用的系统。但目前采用该系统表达的crm197蛋白以包涵体的形式存在，需经过变性、复性的阶段。
5、极端ph值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体。目前大多数是采用6.0 mol/l盐酸胍或8.0 mol/l尿素并结合还原剂来溶解包涵体。但尿素溶解包涵体慢而弱，在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，会导致多肽链的自由氨基甲酞化对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，盐酸胍变性成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
技术实现思路
1、本发明为克服现有技术缺陷，提供了一种crm197包涵体蛋白的变复性方法，能够解决现目前使用的尿素变性剂浓度高进而导致生成杂质沉淀致使所得到的crm197蛋白纯度低、产量低、耗时长的技术问题。
2、本发明目的通过下述技术方案来实现：
3、本发明提供了一种crm197包涵体蛋白的变复性方法，包括如下步骤：s1、将crm197包涵体蛋白用碱液与变性剂的混合变性液溶解后离心，取上清液；s2、将所述上清液初次层析洗脱得到洗脱蛋白；s3、将所述洗脱蛋白超滤后进行二次层析洗脱，即得到纯crm197蛋白；所述s1中，所述碱液为氢氧化钠溶液，所述变性剂为尿素，在所述混合变性液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为8~12mm，所述尿素的浓度为1.8~2.2 m，所述混合变性液的ph为11.5~12.5，所述混合变性液与所述crm197包涵体蛋白的体积-质量比为19~21 ml/g。
4、本发明的原理如下：本发明通过使用氢氧化钠和尿素结合进行碱变性，不仅降低了尿素的使用量，而且碱溶解包涵体的速度更快，进而能够进一步提升整体蛋白的变性速度。
5、在一个实施方式中，所述crm197包涵体蛋白来源于大肠杆菌。
6、在一个实施方式中，在所述s2中，所述初次层析洗脱所用层析柱为q阴离子交换层析柱。
7、在一个实施方式中，在所述s2中，所述初次层析洗脱包括梯度缓冲液洗脱和盐洗脱，所述梯度缓冲液洗脱所用的a液为8~12 mm 氢氧化溶液和1.8~2.2 m尿素的混合液，b液为4.5~5.5 wt%甘油、48~52 mm tris-hcl和0.08~0.12 mol nacl的混合液，所述梯度缓冲液洗脱的洗脱梯度为100%a~100%b、1.9~2.1小时；所述盐洗脱所用的洗脱液为18~22 mmtris-hcl和495~505 mm nacl的混合液；所述a液的ph为11.5~12.5，所述b液和所述盐洗脱的洗脱液的ph均分别为7.5~8.5。
8、在一个实施方式中，在所述s3中，所述超滤包括如下步骤：将所述洗脱蛋白使用30kd膜包等体积置换缓冲液5次，所述置换缓冲液为18~22 mm tris-hcl和48~52 mm nacl的混合液，所述置换缓冲液的ph为7.5~8.5。
9、在一个实施方式中，在所述s3中，所述二次层析洗脱所用的层析柱为deae阴离子交换层析柱。
10、在一个实施方式中，在所述s3中，所述二次层析洗脱包括盐洗脱，所述盐洗脱所用的a液为18~22 mm tris-hcl与48~52 mm nacl的混合液，所述盐洗脱所用的b液为18~22 mmtris-hcl与490~510 mm nacl的混合液，所述盐洗脱的洗脱梯度为100%a~100%b、0.9~1.1小时；所述盐洗脱所用的a液和b液的ph均分别为7.5~8.5。
11、在一个实施方式中，在所述二次层析洗脱中、在所述盐洗脱前还包括前处理，所述前处理包括如下步骤：用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为18~22 mm tris-hcl与48~52 mm nacl的混合液，所述平衡缓冲液的ph为7.5~8.5。
12、在一个实施方式中，在所述s1中，所述离心的离心力为104g，所述离心的温度为4℃。
13、在一个实施方式中，在所述s1中，所述溶解的时间为2 h以上。
14、本发明的主要有益效果在于：
15、减少变性剂的使用，且碱变性速度更快。通过q层析的方式进行蛋白复性，复性效率较常规稀释的方式高，复性后结构正确率高，且具有物料、设备投入低、工艺操作时间短的优点。
1.一种crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，所述crm197包涵体蛋白来源于大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s2中，所述初次层析洗脱所用层析柱为q阴离子交换层析柱。
4.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s2中，所述初次层析洗脱包括梯度缓冲液洗脱和盐洗脱，所述梯度缓冲液洗脱所用的a液为8~12mm 氢氧化溶液和1.8~2.2 m尿素的混合液，b液为4.5~5.5 wt%甘油、48~52 mm tris-hcl和0.08~0.12 mol nacl的混合液，所述梯度缓冲液洗脱的洗脱梯度为100%a~100%b、1.9~2.1小时；
5.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s3中，所述超滤包括如下步骤：将所述洗脱蛋白使用30 kd膜包等体积置换缓冲液5次，所述置换缓冲液为18~22 mm tris-hcl和48~52 mm nacl的混合液，所述置换缓冲液的ph为7.5~8.5。
6.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s3中，所述二次层析洗脱所用的层析柱为deae阴离子交换层析柱。
7.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s3中，所述二次层析洗脱包括盐洗脱，所述盐洗脱所用的a液为18~22 mm tris-hcl与48~52 mmnacl的混合液，所述盐洗脱所用的b液为18~22 mm tris-hcl与490~510 mm nacl的混合液，所述盐洗脱的洗脱梯度为100%a~100%b、0.9~1.1小时；所述盐洗脱所用的a液和b液的ph均分别为7.5~8.5。
8.根据权利要求7所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述二次层析洗脱中、在所述盐洗脱前还包括前处理，所述前处理包括如下步骤：用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为18~22 mm tris-hcl与48~52 mm nacl的混合液，所述平衡缓冲液的ph为7.5~8.5。
9.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s1中，所述离心的离心力为104 g，所述离心的温度为4℃。
10.根据权利要求1所述的crm197包涵体蛋白的变复性方法，其特征在于，在所述s1中，所述溶解的时间为2 h以上。
