本发明属于基因工程，具体涉及一种echs1d疾病动物模型的构建方法及应用。
背景技术：
1、单基因遗传病是指由一对等位基因控制的遗传病。虽然每种单基因遗传病的发病率较低，但因其种类较多，总体患病率并不低.单基因遗传病根据致病基因不同，发病机理也不同，按遗传模式可分为常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、ｘ连锁显性遗传病、ｘ连锁隐性遗传病、连锁遗传病以及线粒体基因组突变导致的遗传病。常见的致病原因包括发育障碍、代谢缺陷以及宿主免疫防御和免疫调节功能异常。近年来，测序技术的飞速发展和广泛应用大大加快了对单基因遗传病的诊断以及新致病突变的鉴定。随着新致病基因的不断发现和对致病机制的深入研究，单基因遗传病的治疗也进入了新时代。临床上针对不同疾病采用的治疗方法各不相同，不同治疗方式在靶向疾病的分子机制方面亦有所不同。
2、利氏综合征（leigh syndrome，又称亚急性坏死性脑病)是一种严重的神经退行性疾病，其特征是以局灶性双侧对称病变为代表的脑部病变，特别是在基底节区、丘脑和脑干，但具有相当大的临床和遗传异质性。临床上，利氏综合征的特征是不同程度的神经系统异常，从严重的神经系统问题到几乎没有病变。最常见的是中枢神经系统受损，表现为精神运动发育迟缓、癫痫发作、眼球震颤、眼轻瘫、视神经萎缩、共济失调、肌张力障碍或呼吸衰竭。自早期发现以来，利氏综合征已被证明不仅具有遗传异质性，而且具有临床异质性，有时会出现非典型但利氏综合征高度相符的神经系统异常疾病，也被称为利氏样综合征。利氏综合征与超过75个基因相关，呼吸链(特别是复合物i、ii、iv或v)、辅酶q或丙酮酸脱氢酶复合物的缺陷可引起利氏综合征或利氏样综合征，呼吸链（oxphos）复合物i的结构和组装因子突变是最常见的致病原因。利氏综合征和利氏样综合征是遗传异质性最广泛的线粒体疾病，少数情况下，非线粒体疾病也可能表现为利氏综合征。
3、echs1（短链烯酰辅酶α水合酶）又称为巴豆酸酶，是一种位于线粒体基质中参与脂肪酸的氧化和必需氨基酸如缬氨酸(val)的降解等多种代谢通路，长度290个氨基酸的蛋白质。echs1缺乏症（echs1d）是由双等位基因突变导致echs1酶活性降低，是一种罕见的线粒体疾病，通常在出生时或幼儿期发病，有些病例在出生后两天内死亡。发病的临床特征以利氏样综合征为代表，表征包括但不限于严重的发育迟缓或倒退、喂养困难、生长迟缓、极度易激惹、中枢性肌张力低下、癫痫发作、代谢性酸中毒、视力障碍和心肌病等。几乎所有已报道的echs1d病例的头颅核磁共振成像(mri)表现与利氏综合征相符，但echs1d的临床表现与利氏综合征的典型特征之间仍有差异。因此将 echs1d归类为一种与严重进行性脑病相关的独特形式的利氏样综合征，伴有双侧脑损伤和线粒体功能障碍。echs1d具有广泛的突变谱系，已经报道了超过六十位患者，包括二十多种错义突变导致的echs1d疾病，而唯一一对兄妹体内发现的纯合子截短突变导致患者在出生48小时内死亡。尽管分子诊断手段已被用于echs1d疾病的诊断中，携带有相同基因突变的患者疾病表征可能大相径庭，因此该疾病的发病症状存在较大的异质性，导致其诊断存在困难，而现在已有的研究仍然对echs1d的发病原因无法确认，导致很难针对echs1d的患者进行治疗。
4、现已报道的利氏综合征和利氏样综合征小鼠模型有五种，这些模型主要聚焦于线粒体呼吸链蛋白的突变。
5、1.线粒体复合物i的组成因子ndufs4基因敲除构建的利氏综合征疾病小鼠模型，ndufs4敲除的纯合子突变型小鼠会出现脑病和致命的呼吸障碍，在出生50天后死亡，适合用于由于利氏综合征带来的神经系统发育及退行性病变，是目前领域内最常用的利氏综合征疾病模型小鼠。
6、2.核基因surf1敲除构建的利氏综合征疾病小鼠模型，sfurf1是线粒体翻译调控组装中间体细胞色素c氧化酶复合物（mitrac复合物）的组成部分，参与调控细胞色素c氧化酶（线粒体复合物iv）的组装。surf1纯合敲除小鼠会出现细胞色素c氧化酶缺乏的线粒体疾病，并伴有胚胎高致死率和繁殖障碍，出生后同样表现为早期自发性死亡，即使成年后其生育能力也表现受损。
7、3.线粒体超氧化物歧化酶(sod)的敲除构建的利氏综合征疾病小鼠，缺乏线粒体锰超氧化物歧化酶的小鼠会积累活性氧，从而表现出与利氏综合征相似的神经系统症状。
8、4.线粒体膜蛋白酶parl敲除构建的利氏样综合征疾病小鼠模型，小鼠表现为类似于利氏综合征的坏死性脑脊髓病，伴随有脑线粒体超微结构变化以及线粒体复合物iii活性、辅酶q (coq)生物合成和线粒体钙代谢受损。parl基因的突变在患者身上更多的表现为帕金森病、leber遗传性视神经病变和2型糖尿病，未报道与利氏样综合征的相关性，因此该模型在探究利氏样综合征上仍具有疑问。
9、5.线粒体复合物ii组成成分sdh蛋白c亚基的敲除引发小鼠表现为利氏样综合征，诱导性敲除的小鼠表现为高乳酸中毒和其他症状，在诱导敲除四周内死亡，解剖未发现组织性损伤。临床上sdh蛋白a亚基的基因突变与利氏样综合征相关，而sdhc的突变大多表现为多种肿瘤易感性上升，该模型在探究利氏样综合征发病机制时仍存在一定的不确定性。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下的技术方案。
2、本发明提供了一种echs1d病动物模型的构建方法，所述动物模型表达echs1基因纯合点突变蛋白，所述点突变位点为p .c225s。
3、进一步，所述点突变位点为c.673t>c。
4、进一步，所述构建方法包括使用crispr/cas9技术和/或talen技术点突变动物模型中echs1基因的步骤。
5、进一步，所述构建方法包括如下步骤：
6、将重组载体通过基因编辑技术注射到单细胞胚胎或胚胎干细胞中，移植到假孕母体中，得到f0代嵌合体个体，f0代嵌合体个体与野生型个体杂交，得到f1代阳性杂合子个体，f1代个体与野生型个体杂交，得到f2代杂合子个体，f2代杂合子个体自交，得到f3代纯合子个体即echs1d病动物模型。
7、进一步，所述基因编辑技术包括crispr/cas9技术和/或talen技术。
8、本发明中使用术语“单细胞胚胎”是指具有细胞全能性，经过分化后能够成长成完整个体的细胞，包括受精卵，胚胎细胞等。
9、本发明中使用术语“胚胎干细胞”是指可以分化成具有不同功能，处于不同部位不同时期的胚胎细胞的干细胞。胚胎干细胞来自早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有高度增殖能力和多向分化潜能，能分化为三个胚层所有细胞类型的原始细胞。根据胚胎干细胞来源不同，分为es细胞，来自囊胚期；ec细胞，由畸胎癌中分离、筛选出来的具有增殖、自我更新能力的细胞；eg细胞，由原始生殖细胞中分离获得。
10、进一步，所述构建方法包括如下步骤：根据echs1基因突变设计、 构建、 体外转录sgrna， 将sgrna连接到同源重组载体上；所述p.[cys225ser]; [cys225ser]点突变为第225位点密码子tgt突变为agt。搜集受精卵并准备待移植受精卵的假孕雌鼠，将cas9、sgrna和同源重组载体导入到小鼠的受精卵中进行同源重组。将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，待小鼠出生后，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，获得f0代嵌合体小鼠。f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，获得阳性f1代杂合子小鼠。f1代小鼠与c57bl/6j小鼠交配，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，获得f2代杂合子小鼠。f2代杂合子小鼠自交，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，获得f3代纯合子小鼠。
11、进一步，所述echs1d病动物模型在f3代出现，所述echs1d病动物模型为点突变echs1基因纯合子。
12、进一步，所述echs1基因纯合点突变的氨基酸序列如seq id no:1所示。
13、所述seq id no:1的序列如下所示：maalrallpracssllssvrcpelrrfasganfqyiitekkgknssvgliqlnrpkalnalcnglieelnqaletfeqdpavgaivltggdkafaagadikemqnrtfqdcysskflshwdhitrvkkpviaavngyalgggcelammcdiiyagekaqfgqpeillgtipgaggtqrltravgkslamemvltgdrisaqdakqaglvskifpveklveeaiqsaekiasnskivvamakesvnaafemtltegnklekrlfystfatddrregmtafvekrkanfkdh。
14、进一步，所述echs1基因纯合点突变包括野生型echs1基因的蛋白编码区序列上第673位核苷酸由t突变为c后形成的核苷酸序列。
15、进一步，所述导入方式包括电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法、显微注射、病毒感染。
16、进一步，所述载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、噬菌体、质粒。
17、本发明中使用的术语“echs1”是指野生型echs1，（ensmusg00000025465），其网址为：http://asia.ensembl.org/mus_musculus/gene/summary?db=core;g=ensmusg00000025465;r=7:140105710-140116476;t=ensmust00000026538。具体到本发明中，echs1基因的点突变针对的转录本为echs1-201（ensmust00000026538.12），针对的位点为c225s，突变位点所在的外显子：exon 6。
18、本发明使用术语“sgrna”是指向导rna（grna），也称作小向导rna（small guiderna，sgrna），是作为动质体体内的一种称为rna编辑的后转录修饰过程。sgrna是一种小型非编码rna，可与pre-mrna配对，并在其中插入一些尿嘧啶，产生具有作用的mrna。向导rna编辑的rna分子，长度大约是60～80个核苷酸，是由单独的基因转录的，具有3'寡聚u的尾巴，中间有一段与被编辑mrna精确互补的序列，5'端是一个锚定序列，它同非编辑的mrna序列互补。
19、在一些实施方案中，所述同源重组载体指一种能促进细胞被选定的核酸转导或该核酸在细胞中表达的组合物。例如，质粒、粘粒、病毒、yac、细菌、聚赖氨酸、染色体整合载体、附加体载体等。
20、在一些实施例中，动物模型为啮齿动物、兔、猪、牛(例如，母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山 羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，绒、猕猴)；优选地，为啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和类似动物)；特别优选地，为小鼠。
21、进一步，所述啮齿动物包括丽仓鼠科、仓鼠科、鼠科、马岛鼠科、刺山鼠科、鼹鼠科、棘鼠科、岩鼠科。
22、进一步，所述鼠科包括黑鼠、褐鼠、沙鼠、新世界大鼠、旧世界大鼠、sd大鼠、波利尼西亚大鼠、树大鼠、木头大鼠、棍棒大鼠、稻米大鼠、袋鼠大鼠、攀鼠。
23、在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大鼠和仓鼠。
24、在一些实施方案中，本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠和大鼠。
25、在一些实施方案中，啮齿动物选自总科鼠总科(muroidea)。
26、在一些实施方案中，本公开的啮齿动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(calomyscidae) (例如，丽仓鼠、巴氏丽仓鼠、古氏丽仓鼠、锦丽仓鼠、郝氏丽仓鼠、髯丽丽仓鼠、楚氏丽仓鼠、乌拉特丽仓鼠)、仓鼠科(cricetidae)(例如黑线仓鼠、田鼠、冠鼠)、鼠科(muridae) (黑鼠、褐鼠、沙鼠、新世界大鼠、旧世界大鼠、挪威种大鼠、波里尼西亚大鼠、树大鼠、棉花大鼠、木头大鼠、棍棒大鼠、稻米大鼠、袋鼠大鼠、攀鼠)、马岛鼠科(nesomyidae)(长尾巨鼠、南非囊鼠、非洲巨鼠、马岛白尾鼠) 、刺山鼠科(platacanthomyidae) (例如，刺山鼠、猪尾鼠)和鼹形鼠科(spalacidae) (例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。
27、在一些实施方案中，本公开的啮齿动物选自小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。
28、在一些实施方案中，本公开的大鼠来自鼠科(muridae)的成员。
29、本发明使用术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。
30、本发明提供了如前面所述的方法产生的动物模型在模拟动物echs1d病方面的应用。
31、本发明提供了如前面所述的方法产生的动物模型在利氏样综合征病理研究方面的应用。
32、本发明提供了如前面所述的方法产生的动物模型在筛选治疗echs1d病、利氏样综合征的药物组合物中的应用。
33、进一步，所述药物组合物包括药学上可接受的辅剂。
34、进一步，所述辅剂包括赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、ph 调节和/或缓冲剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。
35、进一步，所述药物组合物的施用方式包括口服施用、栓剂施用、病灶周围施用、病灶表面施用、局部点用、角膜基质注射施用、结膜下注射施用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
36、本发明提供了一种利用如前面所述的方法产生的动物模型/动物模型细胞筛选一种或多种候选药物的方法，所述方法包括向所述动物模型/动物模型细胞施用所述一种或多种候选药物的步骤。
37、进一步，所述候选药物包括蛋白质类似物、抗体、dna、rna。
38、进一步，所述候选药物包括各种药学上可接受的盐形式。
39、进一步，所述dna 包括单链 dna、闭环 dna、连接 dna。
40、进一步，所述 rna 包括 mrna、trna、rrna、snrna、hrna、反义 rna、tcrna、dsrna、scrna、具有催化活性的 rna、各种病毒 rna。
41、在一些实施方案中，药学上可接受的盐形式包括酸/碱加成盐，具体包括酸加成盐包括但不限于fty720的盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐和水杨酸盐、丙二酸盐、己二酸盐、己酸盐、精氨酸盐、富马酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐或草酸盐，碱加成盐包括但不限于fty720的锂盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐、镁盐、铝盐、铁盐、亚铁盐、铜盐、锌盐，或fty720与吗啉、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三甲胺、赖氨酸或组胺酸。
42、本发明中所使用术语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的效益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
43、本发明中使用术语“抗体”包括有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
44、本发明提供了一种非治疗目的的鉴定治疗echs1d病、利氏样综合征的治疗剂的方法，所述方法包括：向前面所述的方法产生的动物模型中使用药剂，检测动物模型是否有echs1d病、利氏样综合征相关异常症状的变化；当使用药剂对echs1d病、利氏样综合征具有治疗效果时，将所述药剂鉴定为治疗剂。
45、本发明的优点与有益效果：
46、echs1d是一种与线粒体脂肪酸氧化受损相关的遗传性疾病，其疾病表征虽然与利氏样综合征类似，但其临床表型与发病机制却呈现出显著的异质性。其具体发病机制仍存在疑问，echs1参与脂肪酸和氨基酸，其缺乏预期会导致线粒体脂肪酸氧化受损。但由于echs1d患者的长链脂肪酸的膜结合酶机制保持完整，因此在echs1d患者中，酮体生成应该不会完全中断，而且可以假设，由此产生的临床表型应该是与类似于scad缺乏症相似的，较轻且相对良性的临床表型。然而，echs1d患者表现出轻度至中度酮症减少，但既未出现低酮性低血糖和低血糖性脑病，也未出现脂肪酸β氧化水平下降导致的血液中含有酰基肉碱。并且echs1d患者中有三人表现为棕榈酸代谢异常，说明其短链脂肪酸氧化有所受损，而非echs1蛋白参与的长链脂肪酸代谢受损。
47、更为复杂的是，尽管echs1d患者的代谢紊乱预期应导致相对轻微的临床表型，但实际上他们却表现出严重的临床症状，如利氏样综合征、新生儿乳酸酸中毒、感音神经性耳聋、肌张力低下、心肌病和呼吸衰竭的发生率较高等。而echs1d的患者常伴随有神经系统疾病，这在脂肪氧化缺陷相关疾病中相当少见。事实上，echs1d患者的临床表征与长链酰基辅酶α脱氢酶(lchad)缺乏症和线粒体三功能蛋白(mtp)缺乏症有一些临床表征的相似，类似于原发性oxphos缺乏症。由于线粒体脂肪酸氧化中度受损的临床表征与echs1d患者的重度临床表现之间的显著差异，说明echs1d可能不是由于线粒体脂肪酸氧化功能受损导致的，存在另外的病理机制。事实上，短链烯酰辅酶α水合酶（echs1）不仅是缬氨酸在线粒体降解必需酶，还参与其他支链氨基酸的降解。
48、在echs1d中也发现了与利氏综合征类似的继发性oxphos缺陷，这些缺陷的范围从复合体i、复合体iii或复合体iv的孤立缺陷到复合体i/iii/iv或复合体i/iv/v的多个缺陷，虽然目前还不清楚是什么导致了echs1d的这些继发性氧化磷酸化缺陷，目前猜测可能是缬氨酸代谢受损导致的2-甲基丙烯酰辅酶a的累积引发的线粒体复合物oxphos活性丧失，抑制线粒体呼吸。但是很难预测echs1d对oxphos的影响，很多echs1d患者并未表现oxphos的症状，而继发性oxphos缺陷患者通常表现出更严重的利氏样症状，患者也具有更严重的临床表征。因此，echs1d患者与利氏样综合征的关系并不完全对等，现有的利氏样综合征的疾病模型并不完全适用于echs1d患者的发病原因探究。
49、仅有的echs1d小鼠的疾病模型是echs1基因的杂合子敲除小鼠，并未有报道构建echs1点突变小鼠，而echs1基因纯合子敲除小鼠在胚胎早期发育中致死。而echs1杂合子小鼠的疾病表现为癫痫等神经系统疾病，而对于echs1d代谢表征的疾病模型仍然缺乏。不仅如此，由于杂合子敲除小鼠携带一个正常的echs1基因拷贝，其疾病表型可能相对较轻或不明显，这使得在研究echs1缺乏导致的疾病时，杂合子敲除小鼠可能无法充分模拟疾病的病理过程。因此构建echs1d患者突变位点的小鼠模型，这将有助于更准确地研究echs1d的发病机制和原因，阐明echs1d和oxphos功能障碍之间的关系，进一步的研究将揭示echs1缺乏是否会导致oxphos复合体的稳定性和/或生物发生受损，推进线粒体疾病的诊断和治疗，并基于更深入的理解，可以开发更有效的治疗策略，改善患者的生活质量。
50、尽管已经建立了多种线粒体疾病模型，但echs1d的复杂性和异质性仍然需要更深入的研究。构建更精确的echs1d小鼠模型，以及进一步阐明其发病机制，将是未来研究的重要方向。
51、本发明提出了echs1基因225位点氨基酸纯合点突变小鼠模型的构建方法及应用，所述构建方法采用crispr/cas9技术，构建 p .c225s的echs1基因纯合点突变对受精卵进行同源重组，然后移植到假孕雌鼠体内待孕产仔，在f0代小鼠中筛选得到；所述小鼠模型均为echs1c225s基因单位点突变， 而非echs1基因全序列敲除，获得的小鼠表现出细胞线粒体呼吸能力受损，机体代谢缺陷，模拟临床上患者携带的echs1基因225位点突变的代谢受损类型和严重程度。本发明首次针对一种新的echs1基因突变方式：c.[673t>c];[673t>c],p.[cys225arg];[cys225arg]点突变，构建了一种新的小鼠利氏样综合征疾病模型p.[cys225ser]; [cys225ser]，可用于模拟echs1基因纯合点突变导致线粒体机能受损机制，有助于罕见利氏样综合征的机制研究与治疗相关研究。
1.一种echs1d病动物模型的构建方法，所述动物模型表达echs1基因纯合点突变蛋白，所述点突变位点为p .c225s。
2.如权利要求1所述的构建方法，所述点突变位点为c.673t>c。
3.如权利要求1所述的构建方法，所述构建方法包括使用crispr/cas9技术和/或talen技术点突变动物模型中echs1基因的步骤。
4.如权利要求1所述的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
5.如权利要求1所述的构建方法，所述echs1基因纯合点突变的氨基酸序列如seq idno:1所示。
6.如权利要求1-5任一项产生的动物模型在模拟动物echs1d病方面的应用。
7.如权利要求1-5任一项产生的动物模型在利氏样综合征病理研究方面的应用。
8.权利要求1-5任一项产生的动物模型在筛选治疗echs1d病、利氏样综合征的药物组合物中的应用。
9.一种利用如权利要求1-5任一项产生的动物模型/动物模型细胞筛选一种或多种候选药物的方法，所述方法包括向所述动物模型/动物模型细胞施用所述一种或多种候选药物的步骤。
10.一种非治疗目的的鉴定治疗echs1d病、利氏样综合征的治疗剂的方法，所述方法包括：向权利要求1-5任一项产生的动物模型中使用药剂，检测动物模型是否有echs1d病、利氏样综合征相关异常症状的变化；当使用药剂对echs1d病、利氏样综合征具有治疗效果时，将所述药剂鉴定为治疗剂。
