本发明涉及一种cyp2c19基因snp特异性引物多重pcr检测方法，具体涉及一种检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系、试剂盒及方法，属于基因工程及分子生物学领域。
背景技术：
1、cyp2c19基因是一种重要的药物代谢酶，参与了大部分药物的一级代谢（如阿米替林、艾司西酞普兰、丙米嗪、氯吡格雷等），是目前最常检测的药物基因之一。cyp2c19基因的多态性是造成cyp2c19酶活性在个体之间差异的主要原因，携带不同cyp2c19等位基因型的个体可能引起药物反应的极大差异，造成疗效问题或者药物毒副作用（不良反应）。
2、具体来说，cyp2c19基因具有高度多态性，现有的pharmvar数据库收录了包括1，2，3，4，……，39等三十多种等位基因（等位基因由一个或多个变异位点的基因型决定，具体规则参考pharmvar数据库：https://www.pharmvar.org/gene/cyp2c19）。并且，每个等位基因都涉及不同的点突变位点、缺失、插入等，从而不同程度地影响cyp2c19的活性，进而影响对药物的代谢能力、产生不同程度的药物效应。因此，全面的多等位基因检测，以及研究cyp2c19基因多态性对药物疗效和不良反应的影响可以为临床合理用药提供重要的科学依据。
3、目前，检测cyp2c19基因多态性的常规一代测序（sanger测序）检测方法一般仅能检测单个等位基因相关变异位点（如cyp2c192对应的变异位点19154g>a），不但自动化程度低、检测通量低，而且多局限于少数等位基因（2，3，17）的检测，未能覆盖更全面的等位基因范围（如4，5，6，7等），因此不能全面的评估不同等位基因对cyp2c19活性及功能的影响。
4、随着二代高通量测序技术的发展，可以实现一次并行对几十万到几百万条dna序列进行测序，大大提高了测序检测通量。综合检测目的和测序成本，一般先进行目标区域序列富集后测序。常见的序列富集方式包括芯片杂交捕获和多重pcr扩增。其中，芯片杂交捕获能够对整个外显子组甚至更大的目标区域进行捕获和富集，但操作流程复杂，需要依赖专门的仪器设备，适用于较大的目标区域序列富集（如全外显子测序）；多重pcr扩增的实验操作简单，仅需要pcr仪即可进行，能在几个小时内完成目标区域序列的富集和文库构建，适用于相对较小的目标区域序列富集。
5、因此，亟待通过多重pcr引物设计和多次实验优化，设计出一套扩增效果良好的引物组合，从而解决cyp2c19基因28个变异位点同时检测的问题。
技术实现思路
1、针对上述现存的技术问题，本发明公开了一种检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系、试剂盒及方法，通过利用多重pcr技术的引物组合，同时对多个目标区域进行pcr反应和产物富集，以实现对cyp2c19基因28个变异位点的同时检测，从而区分出28种等位基因。
2、为实现上述目的，首先，本发明提供了一种检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系，包括以下引物对的组合：
3、引物对p1，包括上游引物5’-tgtttggaagttgttttgttttgcta-3’（seq id no.1），下游引物5’-caccaacaggtgtcctgttctc-3’（seq id no.2），且扩增产物覆盖变异位点-806c>t；
4、引物对p2，包括上游引物5’-gctcacggttgtcttaacaagagga-3’（seq id no.3），下游引物5’-ccactcctctcccagtgattggaa-3’（seq id no.4）， 且扩增产物覆盖变异位点1a>g，7c>t，10t>c，50t>c，55a>c，83a>t；
5、引物对p3，包括上游引物5’-tttcttgcctgggatctccctc-3’（seq id no.5），下游引物5’-cttgtggaggagttgagaaaaacc-3’（seq id no.6）， 且扩增产物覆盖变异位点12662a>g，12711t>c，12718a>c，12748g>a， 12784g>a，12802g>a；
6、引物对p4，包括上游引物5’-cccactttcatcctgggctgtg-3’（seq id no.7），下游引物5’-ttcctgagaaaccacttacagtct-3’（seq id no.8）， 且扩增产物覆盖变异位点17869g>c，17874g>a， 17948g>a；
7、引物对p5，包括上游引物5’-ccagagcttggcatattgtatctatacctt-3’（seq idno.9），下游引物5’-ggagaaagtaaaagaacaccaagaatcg-3’（seq id no.10）， 且扩增产物覆盖变异位点19153c>t，19154g>a；
8、引物对p6，包括上游引物5’-ccctcgggactttattgattgcttc-3’（seq id no.11），下游引物5’-aacaggtcaaggagtaatgcttgaga-3’（seq id no.12）， 且扩增产物覆盖变异位点19294t>a；
9、引物对p7，包括上游引物5’-tgtcagctaaagtccaggaagagat-3’（seq id no.13），下游引物5’-cacgaggtccagagatacatcga-3’（seq id no.14）， 且扩增产物覆盖变异位点80156g>a，80161a>g， 80174g>a；
10、引物对p8，包括上游引物5’-tgccccatgcagtgacct-3’（seq id no.15），下游引物5’-tcactgggtgagagaagtgcat-3’（seq id no.16）， 且扩增产物覆盖变异位点80290g>a；
11、引物对p9，包括上游引物5’-acagctcagttcacctatgtctctt-3’（seq id no.17），下游引物5’-aactacttcatgcctttctcagca-3’（seq id no.18），扩增产物覆盖变异位点87290c>t；
12、引物对p10，包括上游引物5’-ccctcctatgattcaccgaacagt-3’（seq id no.19），下游引物5’-cccgcatggagctgtttttattcc-3’（seq id no.20）， 且扩增产物覆盖变异位点90033c>t，90060c>t， 90080c>g；
13、引物对p11，包括上游引物5’-ctctgattgacccaaaggacctt-3’（seq id no.21），下游引物5’-agatggtctggctgctcct-3’（seq id no.22）， 且扩增产物覆盖变异位点90209a>c。
14、其次，本发明提供一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒，包括所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系。
15、再者，本发明提供一种检测cyp2c19基因多态性的方法，利用所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系，包括以下步骤：
16、s1、设计cyp2c19基因的多个基因多态性位点的引物对，得到所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系；
17、s2、以待测样本核酸为模板，利用s1得到的检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系进行第一轮pcr扩增，并利用磁珠纯化第一轮pcr产物，得到纯化后的第一轮pcr产物；
18、s3、将s2得到的纯化后的第一轮pcr产物进行第二轮pcr扩增，加上测序接头序列，并利用磁珠纯化第二轮pcr产物，得到纯化后的第二轮pcr产物；
19、s4、将s3得到的纯化后的第二轮pcr产物进行二代高通量测序。
20、本发明进一步的，所述s1包括：使用引物设计软件，先将cyp2c19基因目标区域分割成多个小目标区域，且小目标区域的长度控制在200bp以内，然后针对每个小目标区域分别设计引物对，得到所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系。
21、本发明进一步的，所述s2中，第一轮pcr扩增反应体系包括：enhancer buffer nb(1n) 3.5 ul，enhancer buffer m 2.5ul，primer pool 5ul，igt-em808 polymerasemixture10ul，样本+双蒸水9ul。
22、本发明进一步的，所述s2中，第一轮pcr扩增反应条件为：首先，95℃下3min30s；然后，95℃下20s，55℃下1min30s，60℃下1min30s，60℃下3min，且18个循环；最后，72℃下5min。
23、本发明进一步的，所述s3中，第二轮pcr扩增反应体系包括：enhancer buffer m2.5ul，igt-em808 polymerase mixture 10ul，双蒸水 2ul，udi index（5μm）2ul，第一次纯化后的产物13.5ul。
24、本发明进一步的，所述s3中，第二轮pcr扩增反应条件为：首先，95℃下3min30s；然后，95℃下20s，58℃下1min，72℃下30s，9个循环；最后，72℃下5min。
25、综上，本发明设计的多重pcr引物体系和试剂盒能够快速高效地对cyp2c19基因的28个变异位点（-806c>t，1a>g，7c>t，10t>c，50t>c，55a>c，83a>t， 12662a>g，12711t>c，12718a>c，12748g>a，12784g>a，12802g>a，17869g>c， 17874g>a，17948g>a，19153c>t，19154g>a，19294t>a，80156g>a，80161a>g， 80174g>a，80290g>a，87290c>t，90033c>t，90060c>t，90080c>g，90209a>c）进行富集检测，从而区分出28种等位基因（1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，22，24，25，28，29，32，33，34，35，39），且检测覆盖深度和均一度能达到二代测序对于变异位点准确性的要求。
26、相比现有技术，本发明具有如下有益效果和技术优势：
27、1、效率高：由于多重pcr技术可以利用引物组合，同时对多个目标区域进行pcr反应和产物富集，所以本发明通过引物设计和多次实验优化，设计了出一套扩增效果良好的多重pcr引物体系，解决了cyp2c19基因28个变异位点同时检测的问题，不仅提高了检测的效率，便于全面的评估不同等位基因对cyp2c19活性及功能的影响，而且检测灵敏度更高，特异性更强，结果更准确客观。
28、2、操作简单：本发明仅需通过两轮的pcr反应，即可完成目标区域的富集，并进行二代测序，从而得到待测样本的基因型，简化了操作方法，降低了技术人员的劳动强度。
29、3、成本低：对于涉及变异位点数较多的应用场景，本发明采用的二代测序技术可以高通量和低成本的解决检测问题，相较于一代测序更为成本低廉，有较大的推广优势。
1.一种检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系，其特征在于，包括以下引物对的组合：
2.一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系。
3.一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，所述s1包括：使用引物设计软件，先将cyp2c19基因目标区域分割成多个小目标区域，且小目标区域的长度控制在200bp以内，然后针对每个小目标区域分别设计引物对，得到所述检测cyp2c19基因多态性的多重pcr引物体系。
5.根据权利要求3所述一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，所述s2中，第一轮pcr扩增的反应体系包括：enhancer buffer nb(1n) 3.5ul，enhancer buffer m2.5ul，primer pool 5ul，igt-em808 polymerase mixture 10ul，样本+双蒸水9ul。
6.根据权利要求3或5所述一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，所述s2中，第一轮pcr扩增的反应条件为：首先，95℃下3min30s；然后，95℃下20s，55℃下1min30s，60℃下1min30s，60℃下3min，且18个循环；最后，72℃下5min。
7.根据权利要求3所述一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，所述s3中，第二轮pcr扩增的反应体系包括：enhancer buffer m 2.5ul，igt-em808 polymerasemixture 10ul，双蒸水 2ul，udi index（5μm）2ul，第一次纯化后的产物13.5ul。
8.根据权利要求3或7所述一种检测cyp2c19基因多态性的方法，其特征在于，所述s3中，第二轮pcr扩增的反应条件为：首先，95℃下3min30s；然后，95℃下20s，58℃下1min，72℃下30s，9个循环；最后，72℃下5min。
