本发明属于生物，具体涉及isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白及应用。
背景技术：
1、ifn是宿主细胞在病毒或其他刺激因子的作用下产生的一种具有抗病毒活性的蛋白质，具有广谱的抗病毒作用和免疫调节作用，在天然免疫中发挥着重要功能。干扰素根据其编码基因序列及受体类型不同可分为三大家族：ifn-ⅰ、ifn-ⅱ、ifn-ⅲ。ifn-ⅲ主要由上皮细胞产生，ifn-ⅲ受体由ifn-λ受体1（interferon lambda receptor 1，ifnlr1）和白介素10受体2（interleukin 10 receptor 2，il10r2）组成。ifnlr1受体仅在部分细胞中表达，主要位于上皮细胞，特别在是肾脏、肺和胃肠道的上皮细胞中广泛存在，也存在于一些免疫细胞如中性粒细胞、b淋巴细胞、树突状细胞等。ifn-ⅲ被认为是天然免疫反应中的抗病毒细胞因子，其家族成员均表现出对一系列病毒的抗病毒活性，特别是对胃肠道、肺脏等部位的上皮细胞能够提供有效的抗病毒作用，这主要是由于ifn-ⅲ的ifnlr1受体大部分位于上皮组织。在上皮细胞的病毒感染中，上皮细胞通过表达更多的过氧化酶体和tlr促进ifn-ⅲ的产生并作用于邻近的上皮细胞从而诱导上皮细胞的抗病毒作用。在黏膜相关的病毒感染中，主要依靠上皮细胞产生ifn-ⅲ并作用于邻近的上皮细胞从而发挥抗病毒作用。因此，ifn-ⅲ也被认为是黏膜防御的第一道屏障。
2、ifn-ⅲ也有很强的免疫调节功能。免疫细胞如中性粒细胞表面的ifnlr1受体表达水平较高。当中性粒细胞受到ifn-λ刺激时会激活jak/stat通路，减少活性氧（reactiveoxygen species，ros）的产生和脱颗粒，但不改变中性粒细胞发挥生物活性如产生细胞因子和吞噬的能力，因此降低了感染部位的炎症反应和组织损伤。此外，ifn-λ刺激能够抑制中性粒细胞细胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，nets）的产生并限制中性粒细胞迁移能力。ifn-λ还对nk细胞的活力有影响，能够诱导nk细胞发挥抗肿瘤作用。
3、干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15，isg15）是一种干扰素诱导的泛素样蛋白，属于泛素样蛋白家族成员，在宿主对病毒感染的反应中发挥着重要作用。在天然免疫应答初始阶段产生的isgs中，isg15是ifn刺激细胞后表达水平最高的isgs之一。isg15通过一个三级酶级联反应即isg修饰（isgylation）作用与蛋白底物进行偶联来发挥功能。研究表明，isgylation修饰似乎不直接使靶蛋白降解，而是通过与泛素竞争蛋白上的泛素结合位点来间接调节靶蛋白的降解并影响蛋白的功能。isg15所介导的isgylation对牛痘病毒、新城疫病毒、丙型病毒性肝炎、乙型脑炎病毒等多种病毒具有抑制作用。isgylation可以通过靶向病毒感染细胞时的蛋白质来抑制病毒基因组的复制，还可以通过靶向病毒出芽和释放所需的宿主蛋白来抑制病毒的排出。此外，isgylation能够靶向宿主代谢相关的蛋白质从而影响病毒基因组的复制。除介导isgylation修饰外，isg15也能通过非偶联的形式分泌到细胞外发挥类似细胞因子的作用。在受到ifns刺激后或其他致病因子刺激后，isg15可以被成纤维细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等多种细胞分泌和释放。isg15可以发挥类似细胞因子的功能来参与宿主免疫调节功能。
4、目前，ifn的生产除了从猪白细胞中分离外，主要依靠基因工程方法进行表达纯化。将ifn的目的基因插入宿主基因，诱导宿主基因表达ifn，并通过一定的方法进行纯化，从而获取ifn。常用的ifn表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统、腺病毒表达系统等，杆状病毒和酵母表达系统生产出来的蛋白活性优于大肠杆菌表达系统，能够正确折叠并发挥生物学活性，但是蛋白表达量低、生产周期及生产成本高，难以大规模生产应用。而大肠杆菌表达系统生产成本低、生产周期短、蛋白表达量高，因此利用大肠杆菌表达系统进行ifn的表达更加适合生产实践中的应用。但是，大肠杆菌表达系统产生的蛋白多为包涵体表达，难以正确折叠并复性成功，例如连丹花（“ⅲ型干扰素ifn-λ的表达纯化及活性鉴定”[d]）构建了bl21/pet26b（+）/ ifn-λ3原核表达菌株，并通过1 μg/ml的iptg诱导剂成功诱导出可溶性ifn-λ3重组蛋白，但是重组蛋白在胞周质内总体表达量偏低。
5、因而，如何实现ifn-λ3的大规模生产是ifn-ⅲ制剂开发中面临的重大技术问题。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中ifn-λ3蛋白表达量低、生产周期及生产成本高，难以大规模生产应用的技术问题，本发明旨在提供一种isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白及其应用。
2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白通过连接肽(h4)2将isg15与ifn-λ3连接起来，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
4、第二方面，提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白，所述多核苷酸具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。
5、第三方面，提供多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体含有如本发明所述的多核苷酸。
6、第四方面，提供宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明所述的多核苷酸。
7、第五方面，提供重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3，所述重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3含有如本发明所述的多核苷酸。
8、第六方面，提供重组菌株，所述重组菌株含有如本发明所述的重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3。
9、优选的，所述重组菌株为大肠杆菌。
10、更优选的，所述重组菌株为大肠杆菌bl21（de3）。
11、第七方面，提供一种大规模制备ifn-λ3蛋白的方法，所述方法包括：将本发明所述的重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3转化到感受态细胞后得到重组菌，经诱导表达获得isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白。
12、优选的，所述感受态细胞为感受态细胞bl21（de3）。
13、优选的，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白用于制备预防和/或治疗病毒感染导致的动物疾病的药物，所述病毒为新城疫病毒ndv或猪繁殖与呼吸综合征病毒prrsv。
14、优选的，所述动物为猪。
15、第八方面，提供本发明所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于激活细胞的jak/stat信号通路并诱导isgs的产生。
16、对于现有技术，本发明的有益效果在于：
17、第一，本发明选择不同的连接肽：rl、hl、(h4)2，将isg15与ifn-λ3连接来促进isg15-ifn-λ3的生物活性，研究表明isg15与ifn-λ3通过rl和hl连接后，尽管蛋白表达量有所提升，但在pbs中大量析出，难以复性成功，使用(h4)2连接肽的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白成功复性透析至pbs，且表达量和稳定性显著提升，在同等条件下，本发明选择(h4)2连接肽将isg15和ifn-λ3连接起来，可以实现ifn-λ3蛋白的稳定、大量表达，解决了无法使用原核表达系统大量生产ifn-λ3的技术问题，且其纯化后的产量是rl、hl作为连接肽时的4倍以上，约4.4倍和4.6倍，取得了预料不到的技术效果，为ifn-λ3大规模、低成本量产奠定了基础。
18、第二，本发明在永生化的猪肺泡巨噬细胞crl2843上加入不同剂量的isg15-(h4)2-ifn-λ3处理细胞12h后，检测其诱导下游基因isg15、isg56的能力，western blot和qpcr结果显示isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白能够成功诱导细胞isg15、isg56基因的上调，且诱导水平与isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白剂量呈正相关，表明isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白成功激活了jak/stat信号通路并诱导了isgs的产生，进一步检测isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白对ndv-gfp和prrsv的抑制能力，结果显示gfp阳性细胞数量的减少表明isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白对病毒感染也表现出了抑制作用，这是由于isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白诱导产生的isgs使细胞进入了抗病毒状态，从而抑制了ndv-gfp的增殖，同样，其对于prrsv感染具有抑制作用。可见，本发明表达并纯化的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白具备良好的生物活性，可以用于制备预防和/或治疗病毒感染导致的动物疾病的药物的生产。
1. isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白，其特征在于，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白通过连接肽(h4)2将isg15与ifn-λ3连接起来，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白具有如seqid no:1所示的氨基酸序列。
2. 多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白，所述多核苷酸具有如seq id no:2所示的核苷酸序列。
3.多核苷酸构建体，其特征在于，所述多核苷酸构建体含有如权利要求2所述的多核苷酸。
4.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求2所述的多核苷酸。
5.重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3，其特征在于，所述重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3含有如权利要求2所述的多核苷酸。
6.重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有如权利要求5所述的重组载体pet-28a-isg15-(h4)2-λ3。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌。
8.权利要求1所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重组蛋白在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于激活细胞的jak/stat信号通路并诱导isgs的产生。
