本发明属于磷脂膜整体柱的，具体涉及一种用于抗微生物肽筛选与分离的仿生磷脂膜整体柱的制备方法和应用。
背景技术：
1、在生物体免疫防御机制中，抗微生物肽（amp）又常被称为抗菌肽，作为一类关键的内源性小分子多肽，其独特的作用机制——直接靶向细菌细胞膜而非特定分子识别位点，显著区别于传统抗生素。由于细菌细胞膜的结构和组分在进化过程中高度保守，amp因此展现出难以引发广泛耐药性的优势。加之其广谱抗菌性、卓越的热稳定性、良好的水溶性及低免疫原性，amp被视为抗生素的理想替代品。然而，尽管潜力巨大，但截至目前，自然界中已发现的amp种类极为有限，挖掘率不足0.1%，这主要受制于两方面因素：一是amp在生物体内含量极低，难以满足大规模筛选的需求；二是现有筛选方法多采用经典的瓦克斯曼法，该法虽基于活性制导分离策略，但过程复杂、效率低下、成本高昂，且易导致活性成分损失和肽活性受损。
2、鉴于amp与细胞膜结合在其抗菌机制中的核心地位，膜靶向策略为amp的亲和富集提供了重要思路。尽管已有研究通过固定化大肠杆菌细胞膜实现了amp的筛选，但真实细胞膜的易失活、短寿命等问题限制了其广泛应用。进一步研究表明，amp通过特异性识别细胞膜中的特定磷脂成分（如pe、pg、cl等）发挥作用，这为开发高靶向性的仿生磷脂膜材料提供了理论依据。通过模拟细菌细胞膜的磷脂双分子层结构，不仅简化了材料制备过程，延长了使用寿命，还增强了选择性和稳定性，确保了筛选过程中的特异性。
3、然而，现有模拟细胞膜材料在仿生性和特异性上仍存不足，且传统亲和富集柱在处理复杂样品时面临诸多挑战，如蛋白消耗大、分析时间长、背压高、材质不稳定及色谱性能差等，难以有效筛选微量的amp成分。随着精密微加工技术和新型材料的快速发展，纳升液相与整体柱结合的毛细管亲和整体色谱技术应运而生，为解决上述问题提供了新思路。其中，有机聚合物整体材料以其独特的优势，如制备简便、耐酸碱、性质稳定、柱效高、渗透性好及生物相容性佳，成为提升amp筛选效率的关键。本技术发明人团队长期致力于该领域研究，已成功制备了一系列固定化磷脂的模拟细胞膜整体色谱柱，展现了在amp筛选中的巨大潜力，为开发高效、特异的amp分离纯化与筛选技术奠定了坚实基础。基于此，本专利旨在提供一种创新的仿生磷脂膜整体材料，以期在amp的分离纯化与筛选领域实现技术突破。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于抗微生物肽筛选与分离的仿生磷脂膜整体柱的制备方法和应用。
2、本发明的技术内容如下：
3、本发明提供了一种用于抗微生物肽筛选与分离的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，包括如下步骤：
4、1）磷脂单体的制备：
5、通过化学合成得到含不同脂肪链长度和饱和度的pe/pc/pg/cl可聚合甲基丙烯酸酯单体mdpe、mdpc、mdpg、mdcl，即为功能性磷脂单体；
6、所述mdpe的制备包括：以1,12-十二烷二醇为原料，经酰化反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基醇，与cop反应得到12-（2-氧基-1，3，2-二氧磷杂-2-基）甲基丙烯酸十二酯，之后经氨化反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷酸乙醇胺mdpe；
7、所述mdpc的制备包括：将mdpe与三甲胺进行反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷酸胆碱mdpc；
8、所述mdpg的制备包括：将2-甲基丙烯酰氧十二烷醇、苄基n,n-四异丙基亚磷酰胺和1h-四唑反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷酸甘油苄酯，之后将其通过钯碳催化氢化还原，脱去苄基保护基，得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷酸甘油；
9、所述mdcl的制备包括：以3-对甲苯磺基-1,2-丙二醇和脂肪酰氯制得1,2-二酰基取代甘油，再与苄基n,n-四异丙基亚磷酰胺反应，得到中间体与2-苄氧基-1,3-丙二醇缩合，得到中间体2-苄基-1,3-二[(1,2-二酰基取代-丙三基-3)-磷酰基]甘油二苄基酯，通过钯碳催化氢化还原，脱去苄基保护基，得到1,3-二[(1,2-二月桂酰基-丙三基-3)-磷酰基]甘油，与甲基丙烯酰氧基十二烷酸缩合，得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基心磷脂；
10、所述脂肪酰氯包括月桂酰氯；
11、2）仿生磷脂膜整体柱材料的制备：
12、将上述制备的磷脂单体的一种或以上混合，加入交联剂、生孔剂和引发剂，形成聚合反应液，注入载体基质中，通过原位聚合反应得到磷脂整体柱；
13、所述交联剂包括但不限于乙二醇二甲基丙烯酸酯（edma）、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺（mba）、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯（pegda）以及双（2-甲基丙烯酰氧乙基）磷酸胆碱（mmpc）甲基丙烯酸缩水甘油酯（gma）、苯二乙烯（dvb）的一种以上；
14、所述生孔剂包括但不限于异丙醇、环己醇、1,4-丁二醇、甲醇、四氢呋喃的一种以上；
15、所述引发剂包括但不限于偶氮二异丁腈（aibn）、过氧化二苯甲酰（bpo）、过硫酸钾、过硫酸铵的一种以上；
16、所述载体基质包括改性石英毛细管、改性硅胶、移液器吸头；
17、所述改性石英毛细管经过改性预处理，具体为，将毛细管采用1 mol/l naoh 溶液冲洗，之后灌满1 mol/l naoh 将毛细管两端封口进行高温水浴，水浴完成后采用去离子水冲洗毛细管至ph为中性，之后采用甲醇冲洗毛细管并在氮气中干燥，之后用硅烷偶联剂与甲醇的混合液灌入毛细管中并将两端封口进行水浴加热，反应后先后用甲醇和水分别冲洗之后再进行氮气干燥，即完成毛细管的改性预处理，经过改性的毛细管可以除去杂质的同时，能够让毛细管内壁能够发生聚合反应；
18、所述硅烷偶联剂与甲醇的混合体积比为（1~2）:（1~2）；
19、所述硅烷偶联剂包括γ-氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的一种以上；
20、所述磷脂整体柱包括mdcl磷脂膜整体柱、mdpe磷脂整体柱、mdpg、mdpc磷脂膜整体柱、mdpe/mdpg磷脂膜整体柱、mdpg/mdcl磷脂膜整体柱、mdpc/mdcl磷脂膜整体柱等。
21、本发明还提供了上述制备得到的仿生磷脂膜整体柱在筛选与分离纯化抗微生物肽的应用。
22、本发明的有益效果如下：
23、本发明的用于抗微生物肽筛选与分离的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，通过采用磷脂单体或者混合磷脂制备成仿生磷脂膜整体柱，通过原位聚合反应在石英毛细管内直接制备，简化了制备流程，降低了成本，以及由于采用了多种磷脂单体，整体柱具有更丰富的磷脂种类和更复杂的磷脂膜结构，能够更准确地模拟生物膜环境，提高分离效率和选择性，相比传统的硅胶基质磷脂膜色谱柱，本发明开发形成一种高效、稳定的仿生磷脂膜整体材料，所得磷脂膜整体柱具有更好的酸碱耐受能力，混合磷脂膜整体柱的聚合情况较好，能与毛细管壁实现紧密结合，且结构性能优异，其球状小孔凝聚成较大的分散型大孔隙通道，能够实现烷基苯酮类化合物的分离，并且具有抗非特异性吸附能力，还能用于抗菌肽的分离纯化与筛选，解决现有抗菌肽的筛选和纯化方法存在诸多不足，如效率低下、成本高昂、活性损失等问题，具有重要意义。
1.一种用于抗微生物肽筛选与分离的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述mdpe的制备包括：以1,12-十二烷二醇为原料，经酰化反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基醇，与cop反应得到12-（2-氧基-1，3，2-二氧磷杂-2-基）甲基丙烯酸十二酯，之后经氨化反应得到2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷酸乙醇胺mdpe；
3.根据权利要求1所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括但不限于乙二醇二甲基丙烯酸酯（edma）、n,n'-亚甲基双丙烯酰胺（mba）、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯（pegda）以及双（2-甲基丙烯酰氧乙基）磷酸胆碱（mmpc）甲基丙烯酸缩水甘油酯（gma）、苯二乙烯（dvb）的一种以上。
4.根据权利要求1所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述生孔剂包括但不限于异丙醇、环己醇、1,4-丁二醇、甲醇、四氢呋喃的一种以上。
5.根据权利要求1所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述引发剂包括但不限于偶氮二异丁腈（aibn）、过氧化二苯甲酰（bpo）、过硫酸钾、过硫酸铵的一种以上。
6.根据权利要求1所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述载体基质包括改性石英毛细管、改性硅胶、移液器吸头。
7.根据权利要求6所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述改性石英毛细管经过改性预处理，具体为，将毛细管采用1 mol/l naoh 溶液冲洗后灌满，1 mol/lnaoh 将毛细管两端封口进行高温水浴，水浴完成后采用去离子水冲洗毛细管至ph为中性，之后采用甲醇冲洗毛细管并在氮气中干燥，再用硅烷偶联剂与甲醇的混合液灌入毛细管中并将两端封口进行水浴加热，反应后先后用甲醇和水分别冲洗之后再进行氮气干燥，即完成毛细管的改性预处理。
8.根据权利要求7所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂与甲醇的混合体积比为（1~2）:（1~2）。
9.根据权利要求7所述的仿生磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂包括γ-氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的一种以上。
10.一种权利要求1-9任一项所述制备方法得到的仿生磷脂膜整体柱，其特征在于，所述仿生磷脂膜整体柱在筛选与分离纯化抗微生物肽的应用。
