本发明涉及植物基因工程，更具体地说，涉及一种番茄抗晚疫病基因slprepip2的克隆及其与小肽slpip2的应用。
背景技术：
1、番茄是全世界广泛种植和广受欢迎的果蔬之一，营养丰富，风味独特。由晚疫病菌引起的晚疫病极大地影响了番茄的产量和质量。虽然化学农药对晚疫病的发生和蔓延有一定的控制作用，但由此引发的环境污染，食品安全等问题，给农业生产带来了极大的困扰。因此，对番茄-晚疫病互作机制的研究，使用分子生物学方法提高番茄对晚疫病的抗性成为了较优的研究方向。
2、番茄在长期的驯化过程中，其性状和风味虽然有所改良，但连续的人工选择却降低了它的遗传多样性，使其体内存在的许多抗性基因近乎丢失，这导致部分栽培品种对病原菌的抵抗力下降。庆幸的是，野生番茄品系中还保留着这些宝贵的抗性基因资源，因此，野生与栽培番茄之间的亲缘关系为人们挖掘关键调控因子提供了新的思路，即可将野生种的基因资源引入栽培番茄中，有望提升后者的抗性。先前的研究发现，野生醋栗番茄品系solanum pimpinellifolium“l3708”(简称sp3708)和栽培番茄品种solanum lycopersicum“zaofen no.2”(简称zaofen2)在抗晚疫病方面表现出明显的差异，前者具有高度的抗病性，而后者则相对易感。这意味着，从sp3708番茄中挖掘关键基因并应用于zaofen2，可能是提升栽培番茄抗病性的有效途径。
3、在自然界中，病原菌侵染、机械损伤等各种不利环境因素时刻威胁着植物的生存，而植物往往能够利用一些外源或内源信号分子，识别并有效应对这些胁迫。这些信号分子包括来源于病原菌的病原菌相关分子模式pamp(pathogen-associated molecularpatterns)和来源于植物自身的损伤相关分子模式damp(danger-associated molecularpatterns)。到目前为止，已经确定了许多damp，它们在植物免疫中的功能有了部分理解。植物中的damp主要有胞浆蛋白、肽类、核苷酸和氨基酸等，它们从受损细胞中释放出来或由经历病原体入侵的完整细胞分泌。
4、近年来，在植物中发现了一类新型小肽pips(pamp-induced secretedpeptides)，可以作为一种damp分子，调控植物免疫。pip在大多数被子植物中广泛存在，包括一些重要的农作物中，如马铃薯等。在先前的研究中，许多证据已经确定了pip在植物抗性中的关键作用。例如，拟南芥pips受到flg22和几丁质的诱导，研究发现过表达pip1和pip2前体基因的拟南芥对f.oxysporum f.sp.conglutinans strain 699(foc699)的防御能力增强，外源施加成熟体pip1和pip2不仅能够增加拟南芥对pst dc3000的抵御，还能诱导防御应答基因，如frk1、wrky30和pr1等的转录。与pip1和pip2前体基因的功能不同，pip3前体基因的过表达却导致拟南芥对botrytis cinerea(b.cinerea)和pseudomonassyringae(p.syringae)敏感性增加。马铃薯stpip1的过表达使得植株对potato virus y的敏感度降低。将合成的stpip1外源喷施至马铃薯叶片和茎节后，植株体内的ros水平增加，防御相关基因的表达也随之升高，从而触发了马铃薯的早期防御反应。
5、然而，迄今为止，尚未见slprepip2及其成熟体小肽slpip2在番茄-晚疫病菌互作中的相关研究。
技术实现思路
1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种番茄抗晚疫病基因slprepip2及其克隆方法和应用，以及一种番茄抗晚疫病小肽slpip2及其应用。
2、为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
3、本发明的第一方面，提供了一种番茄抗晚疫病基因slprepip2，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明的第二方面，提供了一种番茄抗晚疫病小肽slpip2，所述小肽slpip2源自基因slprepip2编码的小肽slpip2前体蛋白的c末端，所述基因slprepip2的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述小肽slpip2前体蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述小肽slpip2的氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、本发明的第三方面，提供了一种上述番茄抗晚疫病基因slprepip2的克隆方法，包括如下步骤：
6、sa1、以番茄cdna为模板，使用特异性引物，进行pcr扩增；所述特异性引物如下：
7、slprepip2-fp：gcgggatccatgaaaatgggcacaacaaaatc
8、slprepip2-rp：gcggagctctcaattgtgttcattgtgtacca
9、sa2、将得到的pcr产物与pmd-19t克隆载体连接，得到连接产物pmd-19t-slprepip2；
10、sa3、将连接产物pmd-19t-slprepip2转化大肠杆菌dh5α并涂布在含有氨苄青霉素的lb固体培养基上，挑取单菌落，摇菌后提取质粒，进行质粒pcr后将质粒送测序，测序结果如seq id no.1的质粒即正确。
11、本发明的第四方面，提供了一种上述番茄抗晚疫病基因slprepip2的应用，包括如下步骤：
12、sb1、以番茄cdna为模板，使用特异性引物，进行pcr扩增；所述特异性引物如下：
13、slprepip2-fp：gcgggatccatgaaaatgggcacaacaaaatc
14、slprepip2-rp：gcggagctctcaattgtgttcattgtgtacca
15、sb2、将得到的pcr产物与pmd-19t克隆载体连接，得到连接产物pmd-19t-slprepip2；
16、sb3、用限制性内切酶bamh i及sac i双酶切测序正确的pmd-19t-slprepip2质粒，回收得到目的片段，将所述目的片段与去除gus基因的pbi121表达载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌dh5α并涂布在含有卡那青霉素的lb固体培养基上，挑取单菌落摇菌后提取质粒，进行质粒pcr鉴定后，将质粒送测序，测序正确的即为重组表达载体pbi121-slprepip2；
17、sb4、将重组表达载体导入农杆菌gv3101感受态细胞中并涂布在含有卡那霉素、庆大霉素及利福平的lb固体培养基上，挑取单菌落进行菌液pcr验证，得到阳性工程菌菌液；
18、sb5、取五叶期番茄作为处理对象，以注射的方式向所述五叶期番茄叶片内导入制得的阳性工程菌菌液，进而实现slprepip2的过表达。
19、优选方案下，lb培养基的组份为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l和超纯水。
20、具体地，lb培养基的组成成份为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，超纯水定容至1l。
21、本发明的第五方面，提供了一种上述番茄抗晚疫病小肽slpip2的应用，如下任一项：
22、(1)用于预防/治疗番茄晚疫病；
23、(2)作为作物免疫刺激剂。
24、优选方案下，上述番茄抗晚疫病小肽slpip2的应用，通过如下方式实现：将番茄抗晚疫病小肽slpip2喷施番茄植株。
25、本发明的有益效果
26、1、本发明构建了slprepip2的重组表达载体，借由本发明slprepip2的过表达，可以实现对番茄晚疫病抗性基因的调控。具体地，本发明方法得到的瞬时过表达植株中slprepip2的表达量高于空载植株，其抗晚疫病效果更优。本发明通过过表达slprepip2基因使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。
27、2、由于slpip2小肽前体蛋白编码基因slprepip2可具有增强番茄抗晚疫病的作用，因此，进一步分析其c末端的成熟slpip2小肽是否也具有促进番茄抗晚疫病的功能。本发明还提供一种番茄抗晚疫病小肽slpip2，通过喷施番茄植株，可增强番茄免疫，提高番茄植株对晚疫病菌的抗性，这有助于番茄抗药性的保护和番茄产业的发展。
28、3、slpip2可以提高植物体内抗病蛋白pr的转录积累，pr蛋白可直接影响植株的抗病性。其可以作为一种广泛有用的作物免疫刺激剂，用于番茄对抗多种病原体。因此，我们的研究将为作物保护和农药开发提供新的思路。此外，这些进展可能为作物抗病育种提供参考点，并为现代农业中有效和广谱的疾病管理奠定理论基础。
29、4、使用pbi121载体构建了slprepip2过表达质粒，并将瞬时表达pbi121空载体作为对照组，将slprepip2过表达质粒和pbi121空载体分别在番茄叶片中瞬时表达，3天后，slprepip2的转录活性是番茄叶片中瞬时表达pbi121空载体(ev)的5.3倍。然后，进行离体叶片接种试验。瞬时表达部位感染晚疫病菌五天后，与ev组相比，slprepip2过表达组的病变程度低，病变直径小。
1.一种番茄抗晚疫病基因slprepip2，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种番茄抗晚疫病小肽slpip2，其特征在于，所述小肽slpip2源自基因slprepip2编码的小肽slpip2前体蛋白的c末端，所述基因slprepip2的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述小肽slpip2前体蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述小肽slpip2的氨基酸序列如seq id no.3所示。
3.一种权利要求1所述番茄抗晚疫病基因slprepip2的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.一种权利要求1所述番茄抗晚疫病基因slprepip2的应用，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，lb培养基的组份为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l和超纯水。
6.一种权利要求2所述番茄抗晚疫病小肽slpip2的应用，其特征在于，如下任一项：
7.根据权利要求6所述番茄抗晚疫病小肽slpip2的应用，其特征在于，通过如下方式实现：将番茄抗晚疫病小肽slpip2喷施番茄植株。
