本发明涉及家蚕滞育，尤其是涉及了一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna、制备方法及应用。
背景技术：
1、滞育(diapause)是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，它作为一种遗传特性，在昆虫的生存、进化、繁荣等中发挥着重要的作用。家蚕(bombyx mori)为卵滞育型，二化性(univoltine)品种蚕在正常条件下产滞育卵。滞育卵需要经过长时间低温处理等才能解除其滞育，这给一年多次养蚕带来不便。所以对家蚕滞育现象的研究，一直为人们所关注。
2、蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节(subpharyngeal ganglio n，sg)合成和分泌的滞育激素(diapause hormone，dh)作用。当合成和分泌的dh作用于卵巢和发育中蚕卵，引起多种基因表达上调，从而改变蚕卵内的物质代谢，成为滞育卵。家蚕dh(bmdh)的作用是由家蚕滞育激素受体(bmdhr)来转导的，bmdhr转导bmdh信号的信号通路中需要家蚕kurtz(bmkurtz)蛋白介导。但有关bmkurtz蛋白介导bmdhr信号通路，来调控家蚕卵滞育等缺乏研究。
技术实现思路
1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的方法，是采用rt-pcr克隆，pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pflag-cmv-3连接，与t7反应缓冲液、atp液、ctp液、gtp液、utp液、t7酶液混合反应，再给雌蚕蛹腹部注射的方法，通过调控bmdhr信号通路，让二化性品种家蚕产非滞育卵。
2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、一、一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法
4、(1)解剖并收集五龄第3天的家蚕脂肪体，从中提取总rna，然后逆转录获得第1链cdna；
5、(2)以所述第1链cdna为模板，通过逆转录聚合酶链式反应rt-pcr进行扩增，克隆获得家蚕kurtz cdna；
6、(3)以所述家蚕kurtz cdna为模板，通过pcr扩增并用琼脂糖凝胶电泳回收得到bmkurtz dna片段，将bmkurtz dna片段用hindiii/bamhi酶切，然后与哺乳动物表达载体pflag-cmv-3连接，获得pflag-bmkurtz；
7、(4)以所述pflag-bmkurtz为模板，通过pcr扩增并用琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的目的pflag-bmkurtz dna片段，作为反应模板；
8、(5)将所述反应模板与10×t7反应缓冲液、atp液、ctp液、gtp液、utp液和t7酶液混合进行反应，然后再进行后续处理得到bmkurtz sirna，作为所述sirna。
9、所述步骤(1)具体为：解剖并收集五龄第3天的家蚕脂肪体，使用trizol试剂盒提取总rna，再用逆转录第1链cdna合成试剂对总rna进行逆转录获得第1链cdna，其逆转录条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min。
10、所述步骤(2)具体为：
11、以所述第1链cdna为模板，分别用如seq id no.1的正向引物和如seq id no.2的反向引物进行逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增，克隆获得家蚕kurtz cdna(bmkurtzcdna)，其逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。
12、所述步骤(3)中，bmkurtz dna片段具体采用以下方式获得：
13、以所述bmkurtz cdna为模板，分别用如seq id no.3的正向引物和如seq id no.4的反向引物进行pcr扩增，其pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rtaq酶继续延伸16min。
14、所述步骤(4)中，反应模板具体采用以下方式获得：
15、以所述pflag-bmkurtz为模板，分别用如seq id no.5的特异性引物和如seq idno.6的特异性引物进行pcr扩增，其pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环。
16、所述步骤(5)具体为：
17、(5.1)在一试管内依次加入1.5-2.0μg所述反应模板以及2μl 10×t7反应缓冲液、2μl atp液、2μl ctp液、2μl gtp液、2μl utp液和2μl t7酶液混合物；
18、(5.2)继续补充无核酸酶的双蒸馏水至20μl并充分混合，放置于37℃反应18h，后冷却至常温；
19、(5.3)在步骤5.2获得的混合液中加入1μl turbo dna酶，混匀后于37℃下孵育16min；
20、(5.4)再加入30μl无核酸酶的双蒸馏水、30μl 7.5m氯化锂和50mm edta，终止反应；
21、(5.5)于4℃下15000rpm离心16min，除去上清液，加入1ml 70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；
22、(5.6)于4℃下15000rpm离心16min，除去70％质量百分比的乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到bmkurtz sirna。
23、二、一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna
24、采用步骤一所述制备方法制备而成。
25、三、一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna的应用
26、步骤二中获得的sirna用于注入二化性品种家蚕体内使得家蚕产下非滞育卵。
27、四、一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna的应用方法
28、将步骤二中获得的sirna注射入二化性品种雌蚕蛹腹部，化蛾后正常交配，产下非滞育卵。
29、给产滞育卵的二化性品种家蚕化蛹第2天的雌蚕蛹腹部注射18-22μg经过滤膜除菌的所述sirna，置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，待化蛾后正常交配，产下非滞育卵。
30、本发明的有益效果是：本发明让二化性品种家蚕产非滞育卵的方法，是通过用介导因子bmkurtz调控家蚕滞育激素受体(bmdhr)转导家蚕滞育激素(bmdh)的信号通路来实现的，这对于研究家蚕胚胎滞育机制、进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。
1.一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：解剖并收集五龄第3天的家蚕脂肪体，使用trizol试剂盒提取总rna，再用逆转录第1链cdna合成试剂对总rna进行逆转录获得第1链cdna，其逆转录条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min。
3.根据权利要求1所述的一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：以所述第1链cdna为模板，分别用如seq id no.1的正向引物和如seq id no.2的反向引物进行逆转录聚合酶链式反应扩增，克隆获得家蚕kurtz cdna，其逆转录聚合酶链式反应扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。
4.根据权利要求1所述的一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，bmkurtz dna片段具体采用以下方式获得：以所述家蚕kurtz cdna为模板，分别用如seq id no.3的正向引物和如seq id no.4的反向引物进行pcr扩增，其pcr扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rtaq酶继续延伸16min。
5.根据权利要求1所述的一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，反应模板具体采用以下方式获得：
6.根据权利要求1所述的一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna制备方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为：
7.一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna，其特征在于：
8.一种让二化性品种家蚕产非滞育卵的sirna的应用，其特征在于：
9.利用权利要求7所述sirna让二化性品种家蚕产非滞育卵的方法，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的sirna让二化性品种家蚕产非滞育卵的方法其特征在于：
