本发明涉及分析化学，具体涉及一种测定血清中91种污染物的方法。
背景技术：
1、环境污染物是指经人类活动产生或进入环境，改变了环境的正常组成和性质，并直接或间接对人体造成危害的物质。随着农业生产技术的提高和现代工业的发展，环境污染物随着许多新的化学合成物质融入人们的生活中，在空气、食品和生活用品中均暴露十分广泛。环境污染物可以通过饮食、皮肤、口腔和呼吸道黏膜等多种途径进入人体，并在人体内蓄积，进而干扰人体内天然激素的合成、分泌、运输以及结合，还可以模仿体内天然激素的作用来破坏人体激素的平衡，从而导致人体生殖系统、内分泌系统、心脏和神经系统等产生各种疾病，对人体健康造成重大威胁。
2、双酚类化合物是一种含有两个酚基团的有机化合物，常见的双酚类化合物包括双酚a、双酚f、双酚s等，双酚类化合物被广泛应用于塑料制品、食品包装以及个人护理等产品中。阻燃剂类化合物是一类广泛应用于各种材料中的化合物，其作用是减少材料燃烧时产生的火焰和烟雾，以提高材料的阻燃性能。常见的阻燃剂包括溴系阻燃剂、氮系阻燃剂、磷系阻燃剂等。邻苯二甲酸酯是全球主要环境污染物之一，邻苯二甲酸酯作为增塑剂，常被应用于塑料制品之中，用来提高产品的可塑性、耐用性、稳定性和其他功能特性。全氟和多氟烷基物质是一类具有完全或部分氟化烷基链和一个或多个极性官能团的合成化学品，由于其耐水和耐油性、耐高温性和表面活性，全氟和多氟烷基物质被广泛应用于不粘厨房用具、食品包装、清洁产品等产品中。
3、环境污染物质谱检测技术是一种基于质谱原理的分析技术，该技术可以通过对样品中化合物的质谱特征进行检测和分析，确定样品中的污染物种类和含量。目前，污染物质谱检测技术已经发展出了不同的方法和仪器，主要包括气相色谱质谱联用、液相色谱质谱联用等。污染物质谱检测技术的发展使环境中微量污染物的检测和分析更加准确和灵敏。然而，污染物检测技术仍然存在一些不足之处，比如检测设备成本高、操作步骤复杂、不能直接分析某些化合物等。因此，需要继续改进和完善质谱分析技术，提高分析速度、降低成本、简化操作流程，以满足不同场景下的污染物检测需求。目前，环境污染物的检测技术灵敏度不高，检测物质单一，且缺乏对环境污染物暴露的综合评价的检测方法。
4、目前，对于血清中91种污染物的检测尚无统一标准。国内虽有相关检测污染物的专利，但尚无针对血清中91种污染物的检测方法。因此，为补充血清中91种污染物测定的技术空白，本发明建立一种快速、准确、稳定的处理和检测血清中91种污染物的方法，为污染物与人体健康关系的进一步探索提供基础和前提，具有广大的医学和公共卫生意义。
技术实现思路
1、针对以上现有技术的不足，本发明提供一种测定血清中91种污染物的方法。本发明通过对血清样品进行同位素内标、静置除杂、离心定容，高效提取样品中的污染物；然后采用超高效液相色谱-质谱联用技术，对血清中的污染物进行检测，实现了血清中91种污染物含量的快速准确测定。
2、为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
3、一种测定血清中91种污染物的方法，包括以下步骤：于血清样品中加入包含双酚类同位素化合物、阻燃剂类同位素化合物、邻苯二甲酸酯类同位素化合物、全氟/多氟烷基类同位素化合物的内标溶液后，加入沉淀剂，混匀后离心，收集上清液1；将上清液1于4 ℃静置后离心，收集上清液2；对上清液2进行干燥，加入复溶液混匀后离心，收集上清液3用于超高效液相色谱-质谱检测；
4、所述沉淀剂为甲醇和乙腈，所述甲醇、乙腈的体积比为3: 7；
5、所述复溶液为乙腈和水，所述乙腈、水的体积比为2: 8；
6、所述超高效液相色谱采用的色谱柱为c18色谱柱，洗脱采用的流动相包括流动相a和流动相b，其中，所述流动相a为含有0.01%乙酸和25%甲醇的水溶液，所述流动相b为含有0.01%乙酸和25%甲醇的乙腈溶液。
7、本发明采用特定的前处理方式（以甲醇和乙腈为沉淀剂、以乙腈和水为复溶液，对血清样品进行静置除杂、离心定容处理）对血清样品进行处理，配合特定的洗脱条件（以含有0.01%乙酸和25%甲醇的水溶液为流动相a、以含有0.01%乙酸和25%甲醇的乙腈溶液为流动相b）对污染物进行洗脱，实现了至少91种污染物的同时定性以及定量检测。
8、进一步地，所述污染物包括双酚类化合物、阻燃剂类化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、全氟/多氟烷基类化合物中的一种或多种。
9、更进一步地，所述双酚类化合物包括双酚a（bpa）、双酚p（bpp）、双酚s（bps）、双酚ap（bpap）、六氟双酚a（bpaf）、双酚b（bpb）、双酚f（bpf）、双酚z（bpz）、环己烷-1,2-二羧酸二异壬酯（dinch）、磷酸二苯酯（dphp）、六溴环十二烷（hbcdd）、三溴苯酚（tbp）、四甲基双酚a（tmbpa）、双酚c（bpc）、双酚m（bpm）、双酚bp（bpbp）、双酚芴（bpfl）中的一种或多种。
10、更进一步地，所述阻燃剂类化合物包括二乙基次膦酸铝（alpi）、间苯二酚四苯基二磷酸酯（bpdpp）、磷酸二苯基异辛酯（ehdpp）、磷酸三甲苯酯（tcp）、磷酸三丁氧基乙基酯（tboep）、双酚a双二苯基磷酸酯（bpa-bdpp）、磷酸甲酚二苯酯（dcp）、9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物（dopo）、磷酸三辛酯（tehp）、磷酸三乙酯（tep）、磷酸三甲酯（tmp）、磷酸三苯酯（tphp）、磷酸三异丁酯（tibp）、磷酸三丁酯（tnbp）、磷酸三(2-氯丙基)酯（tcipp）、磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯（tdcipp）、磷酸三(2-氯乙基)酯（tcep）、3-苯磺酰基苯磺酸钾（kss）、十溴二苯醚（do）、三溴苯酚（tbp）、2,3,5,6-四溴对二甲苯（tbbpa）、十溴二苯乙烷（dbdpe）中的一种或多种。
11、更进一步地，所述邻苯二甲酸酯类化合物包括邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（dehp）、邻苯二甲酸二辛酯（dop）、邻苯二甲酸二异丁酯（dibp）、邻苯二甲酸二环己酯（dchp）、邻苯二甲酸二甲氧乙酯（dmep）、邻苯二甲酸二甲酯（dmp）、邻苯二甲酸二戊酯（dpp）、邻苯二甲酸二乙酯（dep）、邻苯二甲酸二壬酯（dnp）、邻苯二甲酸丁苄酯（bbp）、邻苯二甲酸二异壬酯（dinp）、邻苯二甲酸二丁酯（dbp）、邻苯二甲酸二异癸酯（didp）、邻苯二甲酸二异丙酯（diprp）、邻苯二甲酸二苄酯（dbzp）、邻苯二甲酸二丙酯（dprp）、邻苯二甲酸二己酯（dnhp）、邻苯二甲酸二烯丙酯（dap）、邻苯二甲酸二异戊酯（dipp）、邻苯二甲酸二丁氧基乙酯（dbep）、邻苯二甲酸单甲酯（mmp）、邻苯二甲酸单乙酯（mep）、邻苯二甲酸单丁酯（mbp）、苯二甲酸单异丁酯（mibp）、邻苯二甲酸单苄酯（mbzp）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（mehp）、邻苯二甲酸双庚酯（dnhpp）、邻苯二甲酸二庚酯（dihpp）、1,2-苯二羧酸双十一烷基酯（dup）、邻苯二甲酸丁基环己酯（bcp）、邻苯二甲酸正戊基异戊基酯（pipp）、邻苯二甲酸单异丙酯（mipp）、邻苯二甲酸单环己酯（mchp）中的一种或多种。
12、更进一步地，所述全氟/多氟烷基类化合物包括七氟丁酸（pfba）、九氟戊酸（pfpea）、十一氟已酸（pfhxa）、全氟庚酸（pfhpa）、全氟辛酸（pfoa）、全氟壬酸（pfna）、十九氟癸酸（pfda）、全氟十一烷酸（pfunda）、全氟十二烷酸（pfdoda）、全氟十三酸（pftrda）、全氟代十四酸（pfteda）、全氟十六烷酸（pfhxda）、全氟十八烷酸（pfocda）、全氟丁基磺酸（pfbs）、十七氟辛烷磺酸（pfos）、全氟癸烷磺酸（pfds）、全氟辛基磺酰胺（pfosa）、全氟辛基磺酰氟（fx-8）、全氟己基磺酸（pfhxs）中的一种或多种。
13、进一步地，所述内标溶液为氘代邻苯二甲酸单乙基己基酯（mehp-d4）、全氟辛酸-13c4（pfoa-13c4）、磷酸三乙酯-d15（tep-d15）、双酚a-13c12（bpa-13c12）的混合溶液。
14、进一步地，所述双酚类同位素化合物、阻燃剂类同位素化合物、邻苯二甲酸酯类同位素化合物、全氟/多氟烷基类同位素化合物的加入量各为1 ng每100 μl血清。
15、进一步地，所述血清样品与沉淀剂的体积比为1: 4。
16、进一步地，所述血清样品与复溶液的体积比为1: 1。
17、进一步地，所述干燥为在氮气流下进行干燥。
18、进一步地，所述超高效液相色谱的条件参数如下：
19、c18色谱柱规格：100 mm×2.1 mm, 2.0 μm；
20、柱温：40 ℃；
21、进样量：5 μl；
22、流动相的流速：0.3 ml/min；
23、洗脱梯度：0 - 3 min，5% b；3 - 20 min，5 - 98% b；20 - 27 min，98% b；27 -28 min，98% -5% b；28 - 35 min，5% b。
24、进一步地，所述质谱检测的条件参数如下：
25、电离源：电喷雾电离源；
26、离子化模式：正负切换模式；
27、碰撞气体：超高纯度氮气；
28、扫描模式：多反应监测模式。
29、进一步地，所述测定血清中91种污染物的方法，包括以下步骤：
30、（1）对血清进行前处理：向100 μl血清样品中加入1 μl同位素内标溶液、400 μl甲醇与乙腈体积比为3：7的沉淀剂，充分涡旋混匀5 min，随后在4 ℃条件下以12000 rpm离心10 min，收集上清液1；将上清液1在4 ℃条件下静置30 min，随后在4 ℃条件下以12000rpm离心10 min，收集上清液2；将上清液2在氮气流下进行干燥，随后重新溶于100 μl乙腈与水体积比为2 : 8的复溶液中，充分涡旋混匀5 min，在4 ℃条件下以12000 rpm离心10min，收集上清液3上机测定，进样量为5 μl；所述同位素内标溶液为1 μg/ml的氘代邻苯二甲酸单乙基己基酯（mehp-d4）、全氟辛酸-13c4（pfoa-13c4）、磷酸三乙酯-d15（tep-d15）、双酚a-13c12（bpa-13c12）的混合溶液（即混合溶液中，mehp-d4、pfoa-13c4、tep-d15、bpa-13c12的浓度均为1 μg/ml）。
31、（2）使用超高效液相色谱-质谱串联法对91种污染物进行检测：所述超高效液相色谱法采用的 c18色谱柱的规格为100 mm × 2.1 mm, 2.0 μm，色谱柱的柱温为40 ℃，洗脱采用的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为含有0.01%乙酸和25%甲醇的水溶液，所述流动相b为含有0.01%乙酸和25%甲醇的乙腈溶液，所述流动相的流速为0.3 ml/min；所述质谱检测的条件参数为：电离源为电喷雾电离源，离子化模式为正负切换模式，碰撞气体为超高纯度氮气，扫描模式为多反应监测模式。
32、进一步地，所述方法还包括对污染物进行定量分析，所述定量分析包括以下步骤：制备含不同浓度的91种污染物的标准品溶液；对含不同浓度的91种污染物的标准品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱检测；根据91种污染物标准品溶液的浓度与相应的超高效液相色谱-质谱的峰面积绘制标准曲线；根据血清样品中污染物出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，峰面积根据内标同位素含量调整后，对血清样品中的91种污染物进行定量分析。
33、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
34、（1）本发明通过对血清样品进行同位素内标、静置除杂、离心定容处理，然后采用超高效液相色谱-质谱联用技术，对血清中的污染物进行检测，实现了血清中91种污染物含量的同时快速以及准确测定。
35、（2）本发明通过简单的前处理，高效提取血清样品中的污染物，并对其进行定性和定量检测，本发明方法具有简单、高效、成本低等优势，能够用于评估大量生物样本中的污染物暴露情况。
36、（3）本发明在超高效液相色谱-质谱联用检测中采用含有0.01%乙酸和25%甲醇的水溶液、含有0.01%乙酸和25%甲醇的乙腈溶液作为流动相，可提高色谱柱寿命和目标物的分离度。
1.一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，包括以下步骤：于血清样品中加入包含双酚类同位素化合物、阻燃剂类同位素化合物、邻苯二甲酸酯类同位素化合物、全氟/多氟烷基类同位素化合物的内标溶液后，加入沉淀剂，混匀后离心，收集上清液1；将上清液1静置后离心，收集上清液2；对上清液2进行干燥后加入复溶液混匀后离心，收集上清液3用于超高效液相色谱-质谱检测；
2.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述污染物包括双酚类化合物、阻燃剂类化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、全氟/多氟烷基类化合物中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述内标溶液为mehp-d4、pfoa-13c4、tep-d15、bpa-13c12的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述双酚类同位素化合物、阻燃剂类同位素化合物、邻苯二甲酸酯类同位素化合物、全氟/多氟烷基类同位素化合物的加入量各为1 ng每100 μl血清。
5.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述血清样品与沉淀剂的体积比为1: 4。
6.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述血清样品与复溶液的体积比为1: 1。
7.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的条件参数如下：
8.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述质谱检测的条件参数如下：
9.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述测定血清中91种污染物的方法，包括以下步骤：
10.根据权利要求1所述的一种测定血清中91种污染物的方法，其特征在于，所述方法还包括对污染物进行定量分析，所述定量分析包括以下步骤：制备含不同浓度的91种污染物的标准品溶液；对含不同浓度的91种污染物的标准品溶液分别进行超高效液相色谱-质谱检测；根据91种污染物标准品溶液的浓度与相应的超高效液相色谱-质谱的峰面积绘制标准曲线；根据血清样品中污染物出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，峰面积根据内标同位素含量调整后，对血清样品中的污染物进行定量分析。
