本发明属于生物工程，具体涉及一种用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的多肽及其应用。
背景技术：
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)所引发的猪流行性腹泻病，近年在全球范围内爆发并广泛流行，导致新生仔猪致死性水样腹泻的急性、高度传染性肠道疾病病原。由于给养猪业造成巨大的公共卫生威胁和经济负担，目前已经成为威胁养猪业最主要的病原之一。因此，明确该病毒的感染调控、免疫逃逸及致病机制对于该病的防治具有重要的意义。
2、pedv归于冠状病毒科甲型冠状病毒属，是由囊膜包裹的单股正链rna病毒，其基因组全长约为28kb，编码4个结构蛋白即刺突(s)蛋白、包膜(e)蛋白、膜(m)蛋白、核衣壳(n)蛋白，1个辅助蛋白(orf3)，和16个非结构蛋白(nsp 1-16)。
3、在pedv的防控方面，其作为rna病毒极易变异，发生复杂而快速的进化与重组，使接种疫苗的猪群在2010年至今依旧呈现了较高的死亡率。目前流行毒株98％以上属于g2群，尚无针对g2群pedv的足够安全有效的疫苗。猪场一旦发生疫情，治疗药物的重要性逐渐显现。临床上通常以施用干扰素和被动免疫注射pedv特异性卵黄抗体作为治疗手段。干扰素是治疗病毒性疾病的通用药物，缺乏特异性，治疗效果有限。而卵黄抗体存在保护期有限、质量参差不齐等问题。两者都没有直接靶向pedv病毒，难以在实际应用中获得对pedv病毒较好的抑制效果。
4、因此，有必要调整抑制pedv病毒流行的新思路，提出新的解决方案。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的多肽及其应用。
2、为解决技术问题，本发明的解决方案是：
3、提供一种用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的多肽，该多肽是靶向pedv复制阶段的穿膜多肽，并以pedv的核衣壳n蛋白序列中第58位精氨酸作为靶点；该多肽命名为r58a多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、作为本发明的优选方案，该多肽的n端具有穿膜肽修饰，所述穿膜肽为ccps，其序列如seq id no:2所示。
5、本发明进一步提供了利用前述的多肽抑制pedv病毒复制的方法，是以该多肽预孵育ipec-j2、vero或st细胞，在感染pedv后再次加入与预孵育时等量的多肽，裂解细胞并收获样品，检测细胞中pedv-n蛋白的表达。
6、作为本发明的优选方案，进行多肽预孵育时，所用多肽的浓度为1～10μg/ml。
7、本发明还提供了用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的药物组合物，所述药物组合物包括前述的多肽，以及药学上可接受的载体或佐剂。
8、本发明进一步提供了所述多肽组合物在制备用于预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒的疫苗或药物中的应用。
9、发明原理描述：
10、鉴于业内现有预防pedv研究成果的实际应用效果并不理想，本发明提出全新解决思路，提出通过设计一种用于抑制pedv复制能力的多肽，实现打断pedv流行进程的目的。
11、申请人在研究过程中注意到，pedv结构蛋白中的核衣壳(n)蛋白高度保守，并与基因组rna形成复合物，影响病毒rna的合成、包装及病毒颗粒的组装。pedv n蛋白还具有延长细胞dna合成期(s期)、诱导内质网应激以及抑制iii型ifn产生的作用。pedv的n蛋白的n端结构域(ntd)介导rna结合，是影响n蛋白功能的关键结构域。此外，n蛋白所含精氨酸是一种参与多种生物过程的碱性氨基酸，能够提供病毒感染过程中所需的关键营养素。
12、基于上述对n蛋白和精氨酸性能研究的成果，申请人的研究团队明晰了pedv的感染调控机制，创新地提出以pedv的n蛋白中特定靶位的精氨酸作为改造对象，从而为解决方案提供新的思路。在现有研究成果中，尚无关于利用核衣壳(n)蛋白和精氨酸的特性去中断pedv复制过程进而实现抑制病毒流行目的的明确记载。
13、申请人针对pedv n蛋白的n端结构域(ntd)区域内的精氨酸进行了深入研究和繁复筛选，最终证实了核衣壳蛋白第58位精氨酸(n-r58)决定pedv的复制能力，并在此基础上进一步提出下述的多肽设计方案：
14、(1)以pedv n蛋白的n端序列特征为基础，以精氨酸为中心，截取包含该位点在内的20个氨基酸。由于多肽的纯度、反应活性以及合成的难易度与其氨基酸数量有关，一般以30个左右的氨基酸为宜。因此，除含有11个氨基酸的穿膜肽外，本申请提出的目标多肽的长度为20个氨基酸。
15、(2)在确定多肽的氨基酸序列后，将中心精氨酸突变为丙氨酸，并于n端插入穿膜肽序列用于辅助多肽进入细胞，最终合成多肽(命名为r58a)。其中，将中心精氨酸突变为丙氨酸的技术目的是，使该位点的功能失效。
16、通过在pedv自然感染模型中的验证，结果显示本申请得到的r58a多肽能够显著抑制pedv复制。
17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18、1、本发明通过深入研究寻获pedv n蛋白的n端区域中影响病毒复制的关键位点，利用该位点在不同冠状病毒中高度保守的特点，提出将其作为广谱抗冠状病毒药以及冠状病毒减毒疫苗的新靶点。
19、2、本发明进一步基于新靶点提供了靶向pedv复制阶段的穿膜多肽，该多肽在ipec-j2、vero、st细胞的pedv感染模型验证实验中表现的抑制作用十分显著，能够进一步作为活性组分用于制备抗猪流行性腹泻病药物。
20、3、本发明明确了pedv的核衣壳蛋白n端的保守精氨酸是影响pedv感染的关键位点，在此基础上设计靶向该位点的穿膜多肽能够发挥抗病毒功能。本发明的提出，进一步丰富了对pedv感染调控及致病机制的研究策略，为开发新的防治手段提供了新思路。
21、4、本发明也能为科研人员在其他类似冠状病毒的研究工作中，深入了解病毒感染调控规律、寻找防控新线索提供全新启示。
1.一种用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的多肽，其特征在于，该多肽是靶向pedv复制阶段的穿膜多肽，并以pedv的核衣壳n蛋白序列中第58位精氨酸作为靶点；该多肽命名为r58a多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述的多肽，其特征在于，在该多肽的n端具有穿膜肽修饰；所述穿膜肽为ccps，其序列如seq id no:2所示。
3.利用权利要求1所述的多肽抑制pedv病毒复制的方法，其特征在于，是以该多肽预孵育ipec-j2、vero或st细胞，在感染pedv后再次加入与预孵育时等量的多肽，裂解细胞并收获样品，检测细胞中pedv-n蛋白的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行多肽预孵育时，所用多肽的浓度为1～10μg/ml。
5.用于抑制猪流行性腹泻病毒复制的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的多肽，以及药学上可接受的载体或佐剂。
6.权利要求5所述多肽组合物在制备用于预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒的疫苗或药物中的应用。
