本发明涉及合成生物学领域，尤其涉及重组大肠杆菌及其生产l-甲硫氨酸的方法。
背景技术：
1、l-甲硫氨酸(l-met)，又名l-蛋氨酸，系统命名为(s)-2-氨基-4-甲硫基丁酸，属于天冬氨酸家族氨基酸，也是8种必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸。l-甲硫氨酸参与细胞内的转甲基作用，在蛋白质合成、免疫、抗氧化和脂质代谢等方面发挥重要的作用，具有重要的生理功能。而且l-甲硫氨酸是家禽类饲料的第一限制性氨基酸，猪类饲料的第二限制性氨基酸，其作为饲料添加剂是最大的消费市场，在国内的需求量也大幅度增加，另外，l-甲硫氨酸在食品添加剂、医药和化妆品等领域的需求也呈增长趋势。
2、l-甲硫氨酸的合成方法主要包括化学合成法、生物酶催化法与微生物发酵法。通过化学法合成l-甲硫氨酸时，所用原料及中间产物如甲硫醇、氰化物等对环境不友好，并且生成的产物多为d,l-甲硫氨酸，还需进一步的消旋处理才能得到目标产物，操作比较繁琐。生物酶催化法是先利用微生物发酵法生产l-高丝氨酸琥珀酸酯，再加入甲硫醇，通过酶法生产l-甲硫氨酸，具有成本较高、生产调控过程复杂等缺点，不利于大规模工业化生产。
3、微生物发酵法是利用生物质为原料高效合成l-甲硫氨酸，具有反应条件温和、对环境友好等优点。如申请公布号为cn 118109378 a的发明专利，公开了一种高产l-甲硫氨酸的大肠杆菌工程菌及其全发酵法生产l-甲硫氨酸的方法，所述工程菌株以重组菌株m2/pam为出发菌株，在基因组上用强启动子ptrc替换cyspuwam基因簇、cysh基因、trxb基因、trxc基因中一种或多种的原启动子。最终得到的高产l-甲硫氨酸的大肠杆菌工程菌菌株，产量为3.21g/l。但是其在合成l-甲硫氨酸的过程中，依然存在着发酵培养基中硫源利用效率不高的问题，不利于l-甲硫氨酸产量的提升。
技术实现思路
1、为解决上述问题，第一方面，本发明重构了质粒以及导入了该质粒的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌能够通过发酵培养生产l-甲硫氨酸。
2、本发明解决上述问题的技术方案如下：
3、本发明提供了一种质粒，所述质粒为pamz，其是在pam质粒上过表达编码o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶的metz基因得到，所述metz基因来源于铜绿假单胞菌pao1；所述质粒pam是以ptrc99a质粒为基础增强metafbr、yjeh、serafbr的质粒；所述metz基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、seq id no.1：
5、atgactcaagactgggatgcaggtcgtcttgactctgacctggaaggcgctgcgttcgacaccttggcggttcgtgcaggtcagcgtcgtactccagaaggtgaacacggtgaagcgctgttcaccaccagctcttacgtgttccgtaccgcagctgatgctgctgctcgtttcgcaggtgaagttccgggtaacgtttactctcgttacaccaatccgaccgttcgtacctttgaagaacgtatcgcagcgctggaaggtgctgaacaggcggttgctaccgcttctggtatgtctgcaattctggcgctggttatgtctctgtgctcttctggtgatcacgttctggttagccgttctgtgttcggttccaccatctctctgttcgacaagtacttcaaacgtttcggtatccaggttgactatccgccgctgtctgacctggcagcatgggaagctgcgtgcaaaccgaacaccaaactgttcttcgttgaatctccgagcaatccgctggctgaactggttgacatcgcagcactggcagaaatcgctcacgctaaaggtgcgctgctggcggttgataactgcttctgcactccagcactgcaacagccgctgaaactgggtgctgatgttgtgatccactccgcgaccaaatacatcgacggtcagggccgtggtatgggtggtgtagtggcaggccgtggtgaacagatgaaagaagtggttggctttctgcgtaccgctggtccgaccttgtctccgttcaacgcttggctgtttctgaaaggcctggaaactctgcgtatccgtatgcaggcacactccgcatctgcgctggcattggcggaatggctggaacgtcagccaggtatcgaacgtgtttactacgctggtttgccatctcacccgcagcacgaactggcgcgtcgtcagcagtccggtttcggtgcggttgtttctttcgacgttaaaggtggtcgtgacgcagcttggcgtttcatcgacgcgactcgtatggttagcatcaccaccaaccttggcgatactaagaccactatcgcacatccagcgaccacctctcacggtcgtctgtctccagaagatcgtgcacgtgcaggtatcggtgattctctgatccgtgttgcagtaggtctggaagatttggacgacctgaaagcagacatggcacgtggtctggcagctctgtaa
6、本发明还提供了一种质粒，所述质粒为pamzk，其是在所述的pamz质粒上过表达编码nad+激酶的ppnk基因获得；所述ppnk基因来源于谷氨酸棒状杆菌scgg2，所述ppnk基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、seq id no.2：
8、atgactgcgccaactaacgcaggtgaactgcgtcgtgttctgctggttccacacactgg tcgtagctctaacatcgaatctgcgatcttggcggctaaactgctggatgacgcgggtatcgatgttcgtgttctgatcaacgatgcggatgatccaatcgctgaacatccggtattgggccgtttcactcacgttcgtcacgcggcagacgctgcggaaggtgctgaactggttctcgttctgggtggtgatggtacgtttctgcgtgcggcagacatggcgcacgctgttgacctgccggtgctgggtatcaacctgggtcacgttggctttctggctgaatgggaatctgactctctggaagaagctctgaaacgtgttatcgaccgtgactaccgtatcgaagatcgtatgaccttgaccgttgttgttctggacggtggtggtgaagaaatcggtcgtggttgggcgctgaacgaagtgtctatcgagaacctgaaccgtcgtggtgttctggatgctactctggaagttgatgctcgtccggttgcaagtttcggttgcgacggcgttctgatctctactccgactggttctactgcttacgcattcagcgcaggtggtccggttctgtggccagaactggatgcgattctggtagttccgaacaacgcacacgctctgttcaccaaaccgctggtggttagtccgaaatctactgttgctgttgaatctaactctgatacctctgctgctatggctgttatggacggtttccgtccgattccaatgccgccgggtagccgtgttgaagttactcgtggtgaacgtccggttcgttgggttcgtctggactcttccccattcaccgatcgtctggtttccaaactgcgtctgccagttaccggctggcgtggtccgcagaaacaggcggagaacaaagatccgcgtagcgcgggttaa
9、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌通过将上述的质粒转化到底盘菌株中得到。
10、作为优选，所述底盘菌株为m2/pam；所述m2/pam的基因型为e.coliw3110δmetjδmetiδlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc/pam。
11、作为优选，所述重组大肠杆菌为m2/pamz，其是以m2/pam为底盘菌株，在pam质粒上过表达上述的metz基因得到。
12、作为优选，所述重组大肠杆菌是m2/pamzk，其是以上述的重组大肠杆菌m2/pamz为底盘菌株，在pamz质粒上过表达上述的ppnk基因得到。
13、作为优选，所述底盘菌株为m2-hpbc/pam；所述m2-hpbc/pam的基因型为e.coliw3110δmetjδmetiδlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc trc-cysptrc-cysh trc-trxb trc-trxc/pam。
14、底盘菌株m2-hpbc已在申请公布号为cn 118109378 a的发明专利中公开。
15、作为优选，所述重组大肠杆菌为m2-hpbc/pamz，其是以m2-hpbc/pam为底盘菌株，在pam质粒上过表达上述的metz基因得到。
16、作为优选，所述重组大肠杆菌为m2-hpbc/pamzk，其是以上述的m2-hpbc/pamz为底盘菌株，在pamz质粒上过表达上述的ppnk基因得到。
17、上述重组大肠杆菌m2/pamz、m2/pamzk按如下步骤构建：
18、s1、以菌株m2/pam为底盘菌株，在质粒上过表达经过密码子优化的来源于铜绿假单胞菌pao1的o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶metz基因：以pam质粒为模板，pam-x-f/pam-x-r引物获得线性化质粒pam；将线性化质粒pam与seq id no.1所示密码子优化metz基因片段通过同源重组技术连接构建质粒pamz，将质粒转化到菌株m2/pam感受态细胞中得到工程菌m2/pamz，即为能够高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌m2/pamz；
19、s2、以菌株m2/pamz为底盘菌株，在质粒上过表达经过密码子优化的来源于谷氨酸棒状杆菌scgg2的nad+激酶ppnk基因：以pamz质粒为模板，pamz-x-f/pamz-x-r引物获得线性化质粒pamzk；将线性化质粒pamz与seq id no.2所示密码子优化ppnk基因片段通过同源重组技术连接构建质粒pamzk，将质粒转化到菌株m2/pamz感受态细胞中得到工程菌m2/pamzk，即为能够高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌m2/pamzk。
20、第二方面，本发明还提供了上述的重组大肠杆菌生产l-甲硫氨酸的方法，将所述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的lb培养基中，于35～39℃、180～220rpm的摇床上过夜培养12～14h，再将培养液以体积浓度3～8％接种量接种到硫源培养基中，发酵结束后，获得含l-甲硫氨酸的发酵液；所述lb培养基包括：蛋白胨9～11g/l、酵母粉4～6g/l、氯化钠9～11g/l，溶剂为去离子水。
21、作为优选，所述硫源培养基包括基础培养基和硫源，基础培养基(g/l)包括以下质量份的组分：
22、葡萄糖25.0～35.0、kh2po40.5～1.5、mgcl20.1～0.3、酵母粉1.5～2.5、feso4·7h2o 0.003～0.007、mnso4·8h2o 0.003～0.007、znso40.003～0.007，溶剂为去离子水，ph自然；
23、所述硫源(g/l)选自以下质量份组分的组合中的至少一种：
24、(nh4)2so415.0～17.0和na2so41.0～3.0的组合、
25、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o31.0～3.0的组合、
26、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o30.5～1.5和na2so40.5～1.5的组合、
27、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o30.5～1.5和(nh4)2s2o30.5～1.5的组合。
28、作为优选，所述硫源培养基(g/l)包括以下质量份的组分：
29、葡萄糖25.0～35.0、kh2po40.5～1.5、mgcl20.1～0.3、酵母粉1.5～2.5、feso4·7h2o 0.003～0.007、mnso4·8h2o 0.003～0.007、znso40.003～0.007、(nh4)2so412.0～20.0、na2s2o31.0～10，溶剂为去离子水，ph自然。
30、作为优选，所述硫源培养基中硫酸根与硫代硫酸根的质量比为(2～10):(1～2)。
31、作为优选，所述硫源培养基中的发酵培养条件为：27～33℃、180r～220pm条件下发酵培养40～56h。
32、l-甲硫氨酸，系统命名为(s)-2-氨基-4-甲硫基丁酸，在硫源培养基中，硫酸铵作为氮源和硫源，且硫代硫酸钠与硫酸铵组合是适合生产l-甲硫氨酸的硫源组合，硫源物质的利用率高。但培养基中含有硫代硫酸钠时，会产生硫化氢，对重组大肠杆菌的生长造成伤害。
33、通过查阅文献发现，其他微生物可以利用硫化氢合成l-甲硫氨酸，称作直接巯基化途径：即o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶以o-琥珀酰高丝氨酸作为底物，硫化氢作为硫供体，一步合成同型半胱氨酸，再通过甲基化生成l-甲硫氨酸。
34、本发明在pam质粒上过表达编码o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶的metz基因得到pamz；并以m2/pam为底盘菌株，得到重组大肠杆菌m2/pamz，以m2-hpbc/pam为底盘菌株，得到重组大肠杆菌m2-hpbc/pamz。
35、大肠杆菌合成l-甲硫氨酸需要消耗大量的辅因子，合成1mol l-甲硫氨酸需要消耗8mol nadph(还原型辅酶ⅱ)，为提高胞内nadph水平，因此引入谷氨酸棒状杆菌scgg2编码nad+激酶的ppnk基因。
36、所以本发明在pamz质粒上过表达编码nad+激酶的ppnk基因获得pamzk；并以m2/pamz为底盘菌株，得到重组大肠杆菌m2/pamzk，以m2-hpbc/pamz为底盘菌株，得到重组大肠杆菌m2-hpbc/pamzk。
37、使用上述四种大肠杆菌在硫源培养基中通过发酵培养生产l-甲硫氨酸时，能够减少硫化氢对细胞的毒害作用，有利于大肠杆菌生长和l-甲硫氨酸的合成。
38、本发明具有以下有益效果：
39、本发明通过重组大肠杆菌发酵培养生产l-甲硫氨酸，通过对发酵培养时使用的硫源培养基进行硫源优化，提升硫源利用效率，进而提升l-甲硫氨酸产量；
40、在优化过程中利用醋酸铅试纸检测到培养基中有硫化氢的产生，因此在质粒pam中引入表达编码o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶的metz基因，得到质粒pamz，并将其导入到菌株m2/pam、m2-hpbc/pam中，得到重组大肠杆菌m2/pamz和m2-hpbc/pamz，减少硫化氢对细胞的毒害作用，有利于提升l-甲硫氨酸产量，其中m2/pamz菌株的l-甲硫氨酸的产量在摇瓶水平上达到2.80g/l，m2-hpbc/pamz菌株的l-甲硫氨酸的产量在摇瓶水平上达到3.42g/l；
41、进一步在质粒pamz中引入表达编码nad+激酶的ppnk基因，并将其导入到菌株m2/pamz、m2-hpbc/pamz中，得到重组大肠杆菌m2/pamzk和m2-hpbc/pamzk，提高胞内nadph水平，进一步提升l-甲硫氨酸产量，其中，m2/pamzk菌株的l-甲硫氨酸的产量在摇瓶水平上达到3.05g/l，m2-hpbc/pamzk菌株的l-甲硫氨酸的产量在摇瓶水平上达到3.47g/l。
1.一种质粒，其特征在于，所述质粒为pamz，其是在pam质粒上过表达编码o-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶的metz基因得到，所述metz基因来源于铜绿假单胞菌pao1；所述质粒pam是以ptrc99a质粒为基础增强metafbr、yjeh、serafbr的质粒；所述metz基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。
2.一种质粒，其特征在于，所述质粒为pamzk，其是在权利要求1所述的pamz质粒上过表达编码nad+激酶的ppnk基因获得；所述ppnk基因来源于谷氨酸棒状杆菌scgg2，所述ppnk基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌通过将权利要求1～2任一项所述的质粒转化到底盘菌株中得到。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述底盘菌株为m2/pam；所述m2/pam的基因型为e.coli w3110δmetjδmetiδlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc/pam。
5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述底盘菌株为m2-hpbc/pam；所述m2-hpbc/pam的基因型为e.coli w3110δmetjδmetiδlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc trc-cysh trc-cysp trc-trxb trc-trxc/pam。
6.一种重组大肠杆菌生产l-甲硫氨酸的方法，其特征在于，将权利要求3～5任一项所述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的lb培养基中，于35～39℃、180～220rpm的摇床上过夜培养12～14h，再将培养液以体积浓度3～8％接种量接种到硫源培养基中，发酵结束后，获得含l-甲硫氨酸的发酵液；所述lb培养基包括：蛋白胨9～11g/l、酵母粉4～6g/l、氯化钠9～11g/l，溶剂为去离子水。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫源培养基包括基础培养基和硫源，基础培养基(g/l)包括以下质量份的组分：
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫源培养基(g/l)包括以下质量份的组分：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硫源培养基中硫酸根与硫代硫酸根的质量比为(2～10):(1～2)。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫源培养基中的发酵培养条件为：27～33℃、180～220rpm条件下发酵培养40～56h。
