本发明属于基因工程，具体涉及一种可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白、制备方法及应用。
背景技术：
1、胶原蛋白是人和动物体内含量最高的蛋白，约占蛋白质总量的25-30％。目前，在脊椎动物和无脊椎动物中共发现了28种胶原蛋白。其中，iii型胶原蛋白主要分布于皮肤、血管、肌腱、肌肉等组织中，它在维持这些组织的弹性和张力方面起着关键作用。与其他类型的胶原蛋白相比，iii型胶原蛋白通常在组织修复、伤口愈合、保护血管神经、改善细胞微环境、促进组织再生等过程中发挥更为重要的作用。iii型胶原蛋白为主要原料的生物材料在组织工程和再生医学等领域广泛应用。
2、目前，胶原蛋白主要是从动物组织中提取，存在免疫原性、批次间差异大、病毒和疾病传播和过敏反应等多个隐患。且相比于i型胶原蛋白，iii型胶原蛋白在组织中的含量较少，从动物组织中提取iii型胶原蛋白存在难度大、成本高和纯度低等困难。此外，iii型胶原蛋白是由三个相同的α(iii)链构成的同源三聚体蛋白质，这种三螺旋结构使得iii型胶原蛋白具有一定的柔韧性和弹性。传统的胶原蛋白提取方法主要是以酸、碱或蛋白酶等不同处理方法处理动物组织获得胶原蛋白，这些方法易于破坏iii型胶原蛋白的三螺旋结构和生物活性。
3、基因工程技术制备的重组胶原蛋白因其制备工艺固定、组成成分单一、批次间差异较小，可以替代从异源物种中提取的胶原蛋白应用于医学再生领域。目前，转基因动、植物、哺乳动物细胞、细菌、酵母等多种表达系统可用于重组胶原蛋白的制备。相比于其他系统，大肠杆菌表达系统具有培养周期短、成本低、表达量高等优点，是工业化生产胶原蛋白的首选。例如中国专利cn110903383a公开了一种重组人源i型胶原蛋白、编码基因、工程菌及其在制备胶原制剂中的应用，其氨基酸序列为肽段gskgdtgepgpvgvqgppgpageegkrgargep重复9次；中国专利cn105061589a提供了一种重组类人i型胶原蛋白，包括人i型胶原蛋白α1链660-964肽段，n端680-694位的15个氨基酸，以及c端950-964位的15个氨基酸和3组ger氨基酸三联体。但是这些方法制备的重组i型胶原蛋白均缺乏胶原蛋白特征性的三螺旋结构和生物功能。
4、更为重要的是，iii型胶原蛋白具有复杂的三螺旋结构，在大肠杆菌原核表达系统中通常无法形成正确的折叠导致其在表达过程中失去了生物活性，形成不可溶的聚集体，最终形成包涵体，此外胶原蛋白本身的特性也会导致其在大肠杆菌中表达时易于在细胞内聚集形成颗粒，最终形成包涵体，不利于后续胶原蛋白的纯化。
5、针对上述技术问题，本发明提供了一种可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白、制备方法及应用，所述可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白具有胶原蛋白的典型三螺旋结构，严格遵循gly-x-y重复序列；本发明构建的可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白在大肠杆菌表达体系中，纯化简便，制备的产品水溶性良好，质量稳定，可广泛应用于护肤品、皮肤修复敷料、植入物、人工皮肤、生物材料、医疗器械、保健食品等领域。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本发明的目在于提供一种可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白，所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2、优选的，所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3、本发明的第二目的是提供一种携带所述重组三螺旋iii型胶原蛋白的核苷酸序列的重组载体或重组基因工程菌。
4、优选的，所述载体包括pcold或pet，所述工程菌为大肠杆菌。
5、本发明的第三目的是提供所述的三螺旋iii型胶原蛋白的制备方法，所述的iii型胶原蛋白是由蛋白酶处理前体胶原蛋白后得到，所述的前体胶原蛋白为前体胶原蛋白sumo-iii和/或前体胶原蛋白mbp-iii。
6、优选的，所述的前体胶原蛋白sumo-iii的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示；所述的前体胶原蛋白mbp-iii的氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.6所示。
7、优选的，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、凝血酶中的一种或几种。
8、优选的，所述方法具体为：
9、(1)合成编码前体胶原蛋白sumo-iii和前体胶原蛋白mbp-iii的基因序列，所述的前体胶原蛋白sumo-iii的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述的前体胶原蛋白mbp-iii的核苷酸序列如seq id no.6所示；
10、(2)将步骤(1)中所述的基因序列和载体进行连接，转化大肠杆菌，获得重组基因工程菌；
11、(3)培养步骤(2)构建的重组基因工程菌，诱导其表达胶原蛋白，并收集菌体沉淀，破碎得到上清液，经镍柱纯化后获得前体胶原蛋白sumo-iii和前体胶原蛋白mbp-iii；
12、(4)加入蛋白酶对步骤(3)获得的前体胶原蛋白sumo-iii和前体胶原蛋白mbp-iii进行处理，切除n端促溶解标签及纯化标签，得到iii型胶原蛋白；
13、(5)步骤(4)中得到的iii型胶原蛋白经过纯化后获得高纯度的可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白。
14、优选地，所述sumo-iii和mbp-iii前体胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.3和seq id no.5所示。
15、优选地，所述步骤(3)中纯化为亲和层析。
16、优选地，所述步骤(5)中纯化为deae-52阴离子层析。
17、本发明的第四目的是提供所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备皮肤修复敷料、植入剂、生物材料、医疗器械中的应用。
18、本发明的第五目的是提供所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备化妆品、保健品和食品中的应用。
19、本发明的第六目的是提供所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备人工皮肤、人工骨、人工软骨和人工眼角膜中的应用。
20、本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白，与动物源iii型胶原蛋白相比，成分单一、纯度高、批次间差异小、无免疫原性、无病毒传播等隐患；(2)本发明构建的可溶性重组三螺旋sumo-iii型胶原蛋白的大肠杆菌菌株培养周期短、表达iii型胶原蛋白的表达量高、不易形成包涵体；(3)本发明提供的可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白水溶性好，质量稳定、具有胃蛋白酶抗性；(4)所述可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白严格遵守gly-x-y重复氨基酸序列模式，不存在突变导致的疾病风险；(5)所述可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白具有胶原蛋白特征性的三螺旋结构；(6)所述的可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白能够促进细胞增殖、迁移，且细胞毒性低，可广泛应用于护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、生物材料、医疗器械、保健食品等领域。
1.一种可溶性重组三螺旋iii型胶原蛋白，其特征在于，所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白，其特征在于，所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.一种携带权利要求2中所述重组三螺旋iii型胶原蛋白的核苷酸序列的重组载体或重组基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的重组载体或重组基因工程菌，其特征在于，所述载体包括pcold或pet，所述工程菌为大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的三螺旋iii型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述的iii型胶原蛋白是由蛋白酶处理前体胶原蛋白后得到，所述的前体胶原蛋白为前体胶原蛋白sumo-iii和/或前体胶原蛋白mbp-iii，所述的前体胶原蛋白sumo-iii的氨基酸序列如seq idno.3所示，所述的前体胶原蛋白mbp-iii的氨基酸序列如seq id no.5所示。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的前体胶原蛋白sumo-iii的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述的前体胶原蛋白mbp-iii的核苷酸序列如seq id no.6所示。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、凝血酶中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备皮肤修复敷料、植入剂、生物材料和医疗器械中的应用。
9.如权利要求1所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备化妆品、保健品和食品中的应用。
10.如权利要求1所述的重组三螺旋iii型胶原蛋白在制备人工皮肤、人工骨、人工软骨和人工眼角膜中的应用。
