本发明涉及生物检测，尤其涉及一种在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法。
背景技术：
1、胶原蛋白(collagen)占体内蛋白总量的25～30％，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能具有重要作用。胶原蛋白广泛应用于生物医药、化妆品、生物科技等行业，但其来源成为胶原蛋白应用受限的主要原因。胶原蛋白主要有三种来源：(1)传统提取法，虽然提取工艺成熟且活性较高，但存在致病和产生免疫排异反应的风险；(2)化学合成法，解决了免疫排异和病毒隐患，但合成技术比较复杂、成本高、且无生物学活性；(3)基因工程法，利用基因工程技术生产的重组胶原蛋白具有安全性高、批次稳定、活性高、无免疫排异等优点，成为目前胶原蛋白生产的重要研究方向。
2、重组胶原蛋白的生产通常依赖于多种宿主系统，包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞以及转基因动植物等。但无论使用何种宿主，对胶原蛋白表达水平的精确检测这步成为整个流程中不可或缺的环节。特别是以毕赤酵母为表达宿主的情况下，由于外源基因整合到毕赤酵母基因组上，可能产生不同基因剂量的菌株，基因剂量又显著影响毕赤酵母蛋白表达水平，但二者并非是简单的线性关系，而是呈现出非线性的动态变化。这种复杂性更增加了在筛选较高蛋白表达水平的工程菌这步的工作量，导致在进行毕赤酵母生产重组胶原蛋白表达量检测这一环节，需要耗费大量的时间、人力和物力资源。
3、目前，对胶原蛋白的定量检测方法主要有凯氏定氮法、羟脯氨酸分光光度法、sds-page、高效液相色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法、胶原蛋白模拟肽杂交法等。但是，现有检测方法大多数都是对纯化后的胶原蛋白进行鉴定，且存在测定步骤繁琐、成本高、依赖大型设备等缺陷，难以用于大规模生产重组胶原蛋白发酵液的直接定量检测。
4、天狼星红是一种强酸性阴离子染料，每个分子含有6个磺酸基，易与胶原蛋白的碱性氨基酸基团紧密结合，细长的染料分子以平行于胶原纤维的方式附着在胶原纤维上，染色后不褪色且具有特异性。1964年，sweat首次报道了苦味酸天狼星红(sirius red f3ba)作为一种组织学特异性染色法。随后，junqueira等人对该方法进行改进，并将其发展成为组织学领域一种经典的胶原蛋白定性检测技术。目前市场上存在两种基于天狼星红的商业试剂盒，分别为sircol soluble collagen assay和sirius red total collagen assay。然而，这些试剂盒存在一些不可避免的缺陷，例如样品需要经过耗时的前处理步骤，试剂盒价格昂贵且检测结果的准确性有待提高。此外，这些试剂盒使用苦味酸作为溶剂，而苦味酸作为管控药品，在推广应用方面存在障碍，且不适宜在实验室环境中使用。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，该方法使用天狼星红染色法直接对发酵液上清所含蛋白量进行定量检测，能够快速、高效地检测出重组胶原蛋白的高产工程菌株的表达水平，并且具备步骤简单、成本低、无需大型设备、通量高、准确性高、无需受限于管控药品的优点。
2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
3、一种在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，培养用于分泌表达重组胶原蛋白的工程菌与对照菌，并使用天狼星红染色法直接对发酵液上清所含蛋白量进行吸光值检测，检测液包括天狼星红和乙酸；将工程菌吸光值扣除对照菌吸光值，并代入标准曲线，即得目标重组胶原的表达量。
4、作为本发明的优选方式之一，所述用于分泌表达重组胶原蛋白的工程菌指含目标重组胶原蛋白表达载体的菌株；所述对照菌指含空载的对应菌株。
5、作为本发明的优选方式之一，所述天狼星红染色法的检测液中，天狼星红浓度为50μmol/l～350μmol/l。
6、作为本发明的优选方式之一，所述天狼星红染色法的检测液中，乙酸浓度为0.05mol/l～2mol/l。
7、作为本发明的优选方式之一，所述天狼星红染色法检测样品时，样品与检测液的体积比为1：(4～12)。
8、作为本发明的优选方式之一，所述天狼星红染色法检测样品时，样品与检测液的孵育时间为15min～360min。
9、作为本发明的优选方式之一，所述标准曲线根据以下方式获得：使用天狼星红染色法对胶原蛋白标准品进行吸光值检测，根据吸光值与浓度梯度，制作标准曲线。
10、作为本发明的优选方式之一，所述胶原蛋白标准品为牛i型胶原蛋白。
11、作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：
12、(1)制备检测液：配置检测液；
13、(2)准备样品：培养用于分泌表达重组胶原蛋白的工程菌与对照菌，发酵结束后离心，将上清液保存待用；
14、(3)染色：将步骤(1)和(2)得到的溶液混合均匀，静置；
15、(4)离心：待染色完成后离心，弃去上清液，收集复合物沉淀；
16、(5)洗涤：对沉淀进行漂洗，离心，弃去上清液，洗去未结合染料；
17、(6)复溶：向收集到的复合物沉淀中加入naoh溶液复溶，待沉淀完全溶解；
18、(7)检测：检测吸光值；
19、(8)计算：将工程菌检测的吸光值扣除对照菌检测的吸光值后，代入标准曲线，经计算，得待测样品的重组胶原蛋白浓度。
20、作为本发明的优选方式之一，计算公式为：
21、y＝a*x+b；
22、式中，“y”表示吸光值；“x”表示胶原蛋白浓度，mg/l；“a”表示标准曲线斜率；“b”表示标准曲线截距。
23、作为本发明的优选方式之一，待测样品中的重组胶原蛋白包括但不限于i型、ii型、iii型胶原蛋白。同时，本发明待测样品还可以为动物组织提取的胶原蛋白。
24、本发明相比现有技术的优点在于：
25、(1)本发明可以对工程菌表达重组胶原蛋白发酵上清液的蛋白含量进行直接定量检测(迄今为止，尚未有方法能够直接定量检测工程菌发酵液中重组胶原蛋白的表达量)，能够快速、高效地检测出重组胶原蛋白的高产工程菌株的表达水平，解决外源表达重组胶原蛋白高产菌株的检测困难、检测工作量大的问题；
26、(2)本发明的检测方法使用到的天狼星红染色液(天狼星红、乙酸)，价格低廉，且特异性强，无需对胶原蛋白样品进行复杂的预处理和纯化步骤；相对于传统的sds-page检测的繁琐流程，本发明极大地节省了人力、物力、以及时间的投入；同时，检测过程使用的离心机以及酶标仪也是两种实验室常规仪器，本发明能够实现高通量、定量检测外源重组胶原蛋白的表达水平；
27、(3)本发明天狼星红染色法中，无需使用传统的苦味酸类管控药品，便于推广应用；
28、(4)本发明的检测方法中，天狼星红检测胶原蛋白的标准曲线在0～1000mg/l范围内均具有较好的线性相关性，检测结果准确度较高，且不受主观因素影响，同时，平行样品之间具有较低的变异系数；
29、(5)本发明方法的适用范围广，可检测的待测样品为动物组织提取的胶原蛋白或多种宿主系统表达的重组胶原蛋白，不受胶原蛋白序列及肽链长度的限制，且不受胶原体系粘度大的影响，可广泛应用于胶原蛋白产业。
1.一种在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，培养用于分泌表达重组胶原蛋白的工程菌与对照菌，并使用天狼星红染色法直接对发酵液上清所含蛋白量进行吸光值检测，检测液包括天狼星红和乙酸；将工程菌吸光值扣除对照菌吸光值，并代入标准曲线，即得目标重组胶原的表达量。
2.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述用于分泌表达重组胶原蛋白的工程菌指含目标重组胶原蛋白表达载体的菌株；所述对照菌指含空载的对应菌株。
3.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述天狼星红染色法的检测液中，天狼星红浓度为50μmol/l～350μmol/l。
4.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述天狼星红染色法的检测液中，乙酸浓度为0.05mol/l～2mol/l。
5.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述天狼星红染色法检测样品时，样品与检测液的体积比为1：(4～12)。
6.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述天狼星红染色法检测样品时，样品与检测液的孵育时间为15min～360min。
7.根据权利要求1所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述标准曲线根据以下方式获得：使用天狼星红染色法对胶原蛋白标准品进行吸光值检测，根据吸光值与浓度梯度，制作标准曲线。
8.根据权利要求7所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，所述胶原蛋白标准品为牛i型胶原蛋白。
9.根据权利要求1～8任一所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
10.根据权利要求9所述的在工程菌发酵液中高通量检测重组胶原表达水平的方法，其特征在于，计算公式为：
