本发明属于生物，具体涉及一种靶向pd-l1的小分子多肽及其应用。
背景技术：
1、癌症即恶性肿瘤是一种由遗传或病毒等病原微生物、环境危险因素和不良生活方式等多种因素导致的复杂疾病，好发于中壮年，治疗效果不理想、死亡率高。近年来，全球年肿瘤病死率超过千万例，严重影响人民健康，增加社会负担。目前已有多种治疗手段用于临床，包括放疗、化疗、靶向治疗以及免疫治疗等。近年来，免疫治疗在癌症治疗领域取得显著进展。免疫治疗可以激活患者自身的免疫系统，使其能够更有效地识别和摧毁癌细胞，这种治疗方法相对于传统的放疗和化疗，具有特异性强、副作用小的优点，受到广泛关注。
2、肿瘤的免疫治疗是针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法，虽然也存在毒副作用，但相比传统治疗方法更加有效，副作用更小(kennedy lk，salamaak s.areview ofcancer immuno-therapytoxicity[j].cacancer j clin，2020,70(2):86-104；farkona s，diamandis e p，blasutig i m.cancer immu-notherapy：the beginning ofthe end ofcancer[j].bmcmed,2016,14:73)。肿瘤微环境的改变是肿瘤发生发展必不可少的因素。在肿瘤发展过程中，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infilt-rating lymphocytes，tils)在体内对肿瘤细胞的清除是无效的，但去除肿瘤微环境中的免疫抑制时，该细胞又发挥了增殖和肿瘤杀伤的能力。因此，靶向肿瘤微环境中的分子或相关影响因子等改变肿瘤微环境的治疗方式，在治疗癌症过程中具有重要作用(arneth b.tumor microenvironment[j].medicine，2019，56(1)：15.)。
3、在肿瘤免疫治疗中，肿瘤免疫检查点抑制剂的发现被认为是肿瘤治疗里程碑式的突破之一。免疫检查点是一类表达在免疫细胞上发挥抑制性信号传递作用的蛋白分子，通过向免疫细胞内传递抑制信号，可以抑制人体过度激活的免疫反应，进而维持免疫耐受，避免自身免疫性疾病的发生(kitamurat,qian b z,pollard jw.immune cell promotion ofmetastasis[j].nat rev immunol,2015,15(2):73-86；schumacher t n,kesmir c,vanbuuren m m.biomarkers in cancer immunotherapy[j].cancer cell,2015,27(1):12-14；kim n,kim h s.targeting checkpoint receptors and molecules for therapeuticmodulation ofnatural killer cells[j].front immunol,2018,9:2041)。肿瘤细胞利用这一机制，通过表达相应配体与免疫检查点分子结合，抑制免疫系统的激活从而达到免疫逃逸(motz g t,coukos g.deciphering and reversing tumor immune suppression[j].immunity,2013,39(1):61-73.)。免疫检查点阻断疗法(immune checkpoint blockade,icb)是指通过使用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,icis)来阻断免疫检查点分子与其配体的结合，达到重新激活被抑制的免疫细胞并恢复对肿瘤杀伤作用的一种免疫治疗方法(徐向宁,王引弟,吕珍,等.基于pd-1/pd-l1免疫检查点通路中西医结合抗肿瘤治疗的研究进展[j].中国中医基础医学杂志,2024,30(07):1258-1264.)。pd-1和pd-l1是两个常见的免疫检查点蛋白，pd-1与其配体pd-l1的结合可以抑制t细胞活化，促使肿瘤免疫逃逸。因此，阻断pd-1/pd-l1相互作用是治疗肿瘤的重要手段。
4、针对这两个靶点的肿瘤药物开发研究并不充分。尽管已有针对pd-l1的抑制剂取得了一定的疗效，但它们大多是单抗类化合物。单抗类药物存在着一些缺点，如免疫原性强、组织/肿瘤穿透率低、口服生物利用度差、储存运输困难以及生产成本高等(陈光锋,谢艳萍,帅永康,等.新型乳腺癌靶向小分子多肽性能初探[j].解剖学研究,2024,46(03):193-199.)。多肽是由几个到最多50个氨基酸通过肽键连接的氨基酸链，与抗体相比，其具有制造成本低、稳定性高、亲和力高、相对分子质量小，组织渗透性强、血液清除速度快、免疫原性和毒性低、容易制备与易修饰等优势(sun x,li y,liu t,et al.peptide-basedimaging agents for cancer detection[j].adv drug deliv rev,2017,110-111:38-51.)。因此，开发靶向pd-l1小分子多肽抑制剂对丰富肿瘤治疗手段具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明基于机器学习和虚拟筛选技术，筛选出一种靶向pd-l1的小分子多肽，并对其体内和体外生物活性进行了测定，发现该小分子多肽具有诱导pd-l1形成二聚化的能力和良好的抗肿瘤活性，据此完成了本发明。
2、第一方面，本发明提供了一种靶向pd-l1的小分子多肽，所述靶向pd-l1的小分子多肽的序列选自seq id no.1-seq id no.82。
3、进一步，所述靶向pd-l1的小分子多肽是在seq id no.1-seq id no.30基础上进行氨基酸扫描突变获得的突变体多肽。
4、更进一步，所述氨基酸扫描突变包括正电荷氨基酸扫描突变、负电荷氨基酸扫描突变、中性氨基酸扫描突变、稀有氨基酸替换突变和d型氨基酸替换突变。
5、更进一步，所述氨基酸扫描突变后的靶向pd-l1的小分子多肽氨基酸序列如seqid no.31-seq id no.82所示。
6、进一步，所述靶向pd-l1的小分子多肽是在seq id no.1-seq id no.30基础上进行n端或c端的延长或者截断。
7、更进一步，所述延长或截断后的靶向pd-l1的小分子多肽氨基酸序列如seq idno.31-seq id no.82所示。
8、优选的，所述靶向pd-l1的小分子多肽的序列为seq id no.45。
9、第二方面，本发明提供了一种基于机器学习和虚拟筛选技术筛选小分子多肽的方法：
10、s1.构建三维结构数据库：生成四肽的序列及文件，对多肽体系的能量优化，构建四肽的数据库；
11、s2.在数据库中下载配体作为活性分子，为虚拟筛选做准备；
12、s3.提取三维结构特征进行聚类，以筛选出具有与提取的配体相似潜在活性的化合物；
13、s4.将聚类得到的多肽利用分子对接和结合自由能计算进行最终的筛选；
14、s5.对排名靠前的多肽进行固相合成、生物活性测试，筛选出活性最佳的多肽；
15、s6.对s5筛选出的多肽进行结构改造，根据结合自由能筛选出活性最佳的多肽分子。
16、进一步，在步骤s1中，所述四肽的序列通过amber的tleap程序生成，涵盖了20种天然氨基酸在4个位置的随机组合，总计204种组合方式。
17、进一步，在步骤s1中，所述四肽文件包括四肽的prmtop文件和inpcrd文件。
18、更进一步，所述四肽文件通过使用tleap程序导入所需的蛋白和小分子力场，加入na+和cl-以保持体系电荷为0，并对多肽进行溶剂化后获得。
19、更进一步，在溶剂化的过程中，在多肽周围加入tip3pbox水盒子。
20、进一步，在步骤s1中，所述对多肽体系进行能量优化使用amber的pmemd程序执行。
21、更进一步，所述优化过程分为两步，第一步添加溶质约束力，防止溶剂优化过程中溶质分子发生较大的变化；第二步优化消除溶质约束力，对整个系统进行优化；同时生成rst文件。
22、进一步，第二步的所述对整个系统进行优化使用了最陡下降法和共轭梯度法。
23、进一步，在步骤s1中，所述构建四肽的数据库包括提取多肽的三维结构和除去三维结构中的水分子两个步骤，包含16万个四肽。
24、更进一步，所述提取多肽的三维结构是指使用amber的ambpdb程序从prmtop文件和rst文件中提取多肽的三维结构，并输出多肽的pdb文件。
25、进一步，所述除去三维结构中的水分子是指使用pdb4amber程序除去上一步提取的三维结构中的水分子，并生成最终的pdb和mol2格式的结构文件。
26、进一步，在步骤s2中，所述配体是指pd-l1蛋白三维结构中的配体。
27、进一步，在步骤s3中，所述提取三维结构的特征包括获取和转换多肽数据信息。
28、更进一步，所述获取多肽数据信息是指使用pyuul的parsepdb模块读取三维结构的pdb文件，获取多肽数据信息，并将这些信息转移到cuda中。
29、更进一步，所述多肽数据信息包括坐标、原子名称、通道和原子半径等数据。
30、进一步，所述转换多肽数据信息是指利用pyuul的点云转换模块，将读取的多肽文件信息转换为表面积点云数据形式。
31、进一步，在步骤s3中，考虑到四肽所能包含的原子数量都小于500，设置了每个批次中最大点数量为500，以确保处理效率和资源利用的平衡。
32、进一步，在步骤s6中，所述结构改造是指对多肽中氨基酸进行改造。
33、第三方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一方面所述的活性多肽序列，所述融合蛋白具有靶向pd-l1的功能。
34、第四方面，本发明提供一种多聚体，由两个或多个多肽单体聚合而成，其中至少一个多肽单体为第一方面所述的小分子多肽；所述多聚体的各多肽单体之间通过共价连接。
35、进一步，所述多聚体为同源二聚体或异源二聚体。
36、第五方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述小分子多肽或第三方面所述融合蛋白或缀合物。
37、第六方面，本发明提供一种构建体，其包含第五方面所述的核酸分子。
38、第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含第五方面所述的核酸分子和/或第六方面所述的构建体，所述宿主细胞被第三方面所述的核酸分子和/或第四方面所述的构建体转化或转染。
39、第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有第一方面所述小分子多肽、第三方面所述融合蛋白、第四方面所述多聚体、第五方面所述核酸分子、第六方面所述构建体和/或第七方面所述宿主细胞，以及可选的药学上可接受的辅料。
40、第九方面，本发明提供第一方面所述小分子多肽、第三方面所述融合蛋白、第四方面所述多聚体、第五方面所述核酸分子、第六方面所述构建体或第七方面所述宿主细胞在制备预防和/或治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。
41、进一步，所述肿瘤相关疾病包括但不限于头颈部鳞癌、鼻咽癌、三阴乳腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌、食道癌、胸膜间皮瘤、胃癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、肾癌、尿路上皮癌、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、皮肤鳞癌、某些特殊类型的软组织肉瘤、包括结直肠癌在内的dmmr/msi-h实体瘤和tmb≥10mut/mb的实体瘤等。
42、有益效果
43、1、本发明利用机器学习和虚拟筛选的方法得到了seq id no.1-seq id no.82的一系列多肽分子；其中，seq id no.45这一多肽分子活性最高，在分子水平上可以与pd-l1结合，其kd为9.121×10-7。
44、2、本发明筛选出的小分子多肽在分子和细胞水平均具有诱导pd-l1形成二聚化的作用。
45、3、本发明筛选出的小分子多肽在增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用方面的巨大潜力；在动物实验中，相同浓度下，小分子多肽抑制活性优于pd-l1单抗对照组和小分子抑制剂对照组(bms202)，且以剂量依赖的趋势的增加对肿瘤的抑制率；当浓度为20mg/kg时，其对肿瘤重量的抑制率达到83％。
46、4、实验期间，小分子多肽治疗组的小鼠体重几乎没有变化，表明小分子多肽没有明显的毒性，具有一定的安全性。
47、5、pd-l1是与肿瘤相关的靶点，得到的小分子多肽，能够抑制pd-l1和pd-1的结合，有望开发成为新的小分子多肽类pd-l1抑制剂药物。
1.一种靶向pd-l1的小分子多肽，所述靶向pd-l1的小分子多肽的序列选自seq idno.1-seq id no.82；所述靶向pd-l1的小分子多肽是在seq id no.1-seq id no.30基础上进行氨基酸扫描突变获得的突变体多肽，所述氨基酸扫描突变包括正电荷氨基酸扫描突变、负电荷氨基酸扫描突变、中性氨基酸扫描突变、稀有氨基酸替换突变和d型氨基酸替换突变，所述氨基酸扫描突变后的靶向pd-l1的小分子多肽氨基酸序列如seq id no.31-seqid no.82所示；所述靶向pd-l1的小分子多肽是在seq id no.1-seq id no.30基础上进行n端或c端的延长或者截断的多肽，所述延长或截断后的靶向pd-l1的小分子多肽氨基酸序列如seq id no.31-seq id no.82所示；优选的，所述靶向pd-l1的小分子多肽序列为seq idno.45。
2.一种基于机器学习和虚拟筛选技术筛选小分子多肽的方法：
3.如权利要求2所述筛选方法，在步骤s1中，所述四肽的序列通过amber的tleap程序生成，涵盖了20种天然氨基酸在4个位置的随机组合，总计204种组合方式；所述四肽文件通过使用tleap程序导入所需的蛋白和小分子力场，加入na+和cl-以保持体系电荷为0，并对多肽进行溶剂化后获得；所述对多肽体系进行能量优化使用amber的pmemd程序执行，包括添加溶质约束力和优化消除溶质约束力两个步骤；所述构建四肽的数据库包括提取多肽的三维结构和除去三维结构中的水分子两个步骤，包含16万个四肽；
4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1所述的小分子多肽序列，所述融合蛋白具有靶向pd-l1的功能。
5.一种多聚体，由两个或多个多肽单体聚合而成，其中至少一个多肽单体为权利要求1所述的小分子多肽；所述多聚体的各多肽单体之间通过共价连接；所述多聚体为同源二聚体或异源二聚体。
6.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述小分子多肽或权利要求4所述融合蛋白或缀合物。
7.一种构建体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的构建体，所述宿主细胞被权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的构建体转化或转染。
9.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述小分子多肽、权利要求4所述融合蛋白、权利要求5所述多聚体、权利要求6所述核酸分子、权利要求7所述构建体和/或权利要求8所述宿主细胞，以及可选的药学上可接受的辅料。
10.权利要求1所述小分子多肽、权利要求4所述融合蛋白、权利要求5所述多聚体、权利要求6所述核酸分子、权利要求7所述构建体或权利要求8所述宿主细胞在制备预防和/或治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用；所述肿瘤相关疾病包括但不限于头颈部鳞癌、鼻咽癌、三阴乳腺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌、食道癌、胸膜间皮瘤、胃癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、肾癌、尿路上皮癌、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、皮肤鳞癌、某些特殊类型的软组织肉瘤、包括结直肠癌在内的dmmr/msi-h实体瘤和tmb≥10mut/mb的实体瘤等。
