本发明属于生物工程，具体涉及细菌基因组大尺度dna片段遗传操作的方法。
背景技术：
1、许多病原菌的外膜多糖都是机体良好的保护性抗原，具有较高的科研与应用价值。负责编码与合成这种多糖结构的dna序列信息主要是以“基因簇”的形式存在于细菌基因组上，比如，常见的细菌荚膜多糖和o抗原多糖基因簇等。一般而言，这些基因簇的dna大小普遍都在10kbp以上，属于“大尺度”的dna片段。因此，想要获取这种多糖物质，一般就两种思路：一是从病原菌本身直接提取；二是将它的整个基因簇进行“克隆与表达”，再从宿主菌中间接提取。前者的主要问题是病原菌本身可能存在难培养、培养成本高及生物安全风险等问题，而后者的主要问题是大尺度dna片段的遗传操作问题。
2、目前，借助重组质粒很容易就能实现单个基因或小片段dna的克隆与表达，而且，这种重组质粒的构建通过常规的分子生物学方法就能轻松实现。但是，重组表达大尺度的dna片段(>10kbp)目前却存在着各种问题。比如，一般的表达质粒在插入大片段dna后，都会出现遗传上的不稳定性等问题。因此，为了克服这种不稳定性问题，就需要引入多种“稳定机制”，比如，在普通质粒骨架上插入一些“partition system”dna元件等。目前，能稳定容纳这种“基因簇”级别的大片段dna只有数量和种类都非常少的cosmids或fosmids质粒。由于这些质粒各自的复制子不同，它们的拷贝数在不同宿主菌之间差异较大，而且它们还受到宿主菌的生长状态、培养基的具体成分及菌株个体间差异的影响等。此外，重组质粒还有一个普遍性的缺点，即需要借助抗生素的选择性压力来维持自身在宿主菌中的稳定表达，然而抗生素的使用会带来生物制品过敏的风险，也会增加其生产过程中的制造成本。
3、借助细菌基因组容纳大尺度的外源基因簇就不存在上述问题，这种策略有诸多优势，如遗传稳定性好，表达水平均一，培养时不需要额外添加抗生素等。现有的遗传操作技术能很好的将小片段dna序列(如2～5kbp)定点插入到细菌基因组中，但是，如果想要将大尺度的dna片段(>10kbp)也定点插入到细菌基因组中，目前仍存在一定困难。
4、专利文献(wo2014057109a1)通过以下几个关键步骤实现了大尺度基因簇的细菌基因组定点插入：1)分别构建pdoc和ptkred两个质粒；pdoc携带有两个相邻的scel限制性酶切位点；ptkred能表达scel限制性内切酶和λ-red系统重组酶；2)在pdoc质粒两个scel位点之间，按顺序依次插入待插入位点的上游同源片段序列(上同源臂)、目标基因簇、两端带有frt特征序列的抗性筛选基因及待插入位点的下游同源片段序列(下同源臂)，最终得到一个新的pdoc重组质粒；3)将pdoc重组质粒和ptkred质粒先后转入到大肠杆菌w3110中，scel限制性内切酶把“上同源臂+目标基因簇+抗性基因+下同源臂”整体从pdoc重组质粒上“切割”下来，“切割片段”在重组酶的作用下，与大肠杆菌w3110发生基因组水平的同源交换，得到目标基因簇定点插入到了大肠杆菌w3110基因组的突变株；4)通过frt酶消除掉抗性筛选标记，最终得到无抗筛选标记，但带有frt“疤痕”的基因簇基因组定点插入突变株。
5、上述方案也会存在一些缺点：1)将超大的pdoc重组质粒转入到大肠杆菌中可能会遇到一定困难，将pdoc和ptkred两个质粒都转入到大肠杆菌中会更困难；2)大尺度dna片段的“切割”需要借助scei限制性内切酶，而pdoc重组质粒本身在大肠杆菌中的拷贝数又有限，因此，大尺度dna片段在大肠杆菌胞质中的“有效释放量”会有限，插入突变的成功率可能会偏低。3)该方案最终会在基因组上留下一个frt特征序列的“疤痕”，不能做到无痕插入突变。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是为大尺度dna片段的遗传操作提供一种新选择。
2、本发明的技术方案是一种适用于细菌基因组大尺度dna片段遗传操作的载体，以自杀质粒载体为骨架载体，携带以下结构：条件性复制起点、同源重组元件、正筛选标记、负筛选标记和可转移元件；所述同源重组元件为缺失同源重组元件或插入同源重组元件。
3、条件性复制起点即载体的自我复制需要特殊的转录因子。如pre112质粒，它含有r6κori条件性复制起点，其自我复制能力依赖于特殊的pir因子，宿主菌中有该因子，这个质粒就能自我复制，反之就不行。pir基因不在一般的宿主菌表达，只会在一些特殊的工程菌(如χ7232和χ7213)中表达。
4、进一步的，所述缺失同源重组元件的结构为待缺失目标片段的上游同源臂-待缺失目标片段的下游同源臂元件，所述目标片段为基因或基因簇。
5、进一步的，所述插入同源重组元件的结构为操作位点上游同源臂-待插入目标片段-操作位点下游同源臂的元件，所述操作位点为背景菌株中待插入目标片段的预定插入位点，所述目标片段为基因或基因簇。
6、其中，所述目标片段长度为10～30kbp。
7、具体的，所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇。
8、具体的，所述正筛选标记为抗生素标记。
9、优选的，所述抗生素标记氯霉素cm、卡那霉素kan、壮观霉素spec、庆大霉素gm或氨苄霉素amp。
10、其中，所述负筛选标记为sacb、lacy或phes。
11、进一步的，所述骨架载体为pre112。
12、具体的，在带痕插入时，所述插入同源重组元件的结构为：操作位点上游同源臂-待插入目标片段-frt-抗性基因-frt-操作位点下游同源臂的元件；且抗性基因与正筛选标记不相同。
13、优选的，所述抗性基因为抗氯霉素cm、卡那霉素kan、壮观霉素spec、庆大霉素gm或氨苄霉素amp的基因。
14、本发明还提供了含有所述载体的表达系统。
15、优选的，所述表达系统还包含有表达frt位点特异性重组酶的载体。
16、具体的，所述表达frt位点特异性重组酶的载体为pcp20质粒。
17、本发明的技术方案是一种细菌基因组大尺度dna片段无痕缺失的遗传操作方法，包括如下步骤：
18、s1、构建缺失同源重组元件；所述缺失同源重组元件的结构为待缺失目标片段的上游同源臂-待缺失目标片段的下游同源臂；
19、s2、将步骤s1得到缺失同源重组元件连接到线性化的自杀质粒骨架载体上，转化工程菌，筛选出阳性株；所述自杀质粒骨架载体上携带有正筛选标记、负筛选标记和可转移元件；
20、s3、将步骤s2得到阳性株与待缺失目标片段的背景株进行结合转移，筛选出阳性株，即完成对目标片段的遗传操作。
21、具体的，步骤s1中，缺失同源重组元件的构建过程如下：扩增待缺失目标片段的上游同源臂和待缺失目标片段的下游同源臂，通过融合pcr将两者融合，即得。
22、具体的，步骤s2的操作为：利用环pcr方法，将缺失同源重组元件与线性化的自杀质粒载体上，转化大肠杆菌χ7232，筛选出阳性菌株，提取重组自杀质粒，再次转化大肠杆菌χ7213，筛选出阳性株。
23、其中，步骤s2中，所述工程菌为大肠杆菌。
24、具体的，所述正筛选标记为抗生素标记。
25、优选的，所述抗生素标记cm、kan、spec、gm或amp。
26、其中，步所述自杀质粒载体上的负筛选标记为sacb、lacy或phes。
27、进一步的，步骤s2中，所述自杀质粒骨架载体为pre112。
28、其中，步骤s1中，所述目标片段长度为10～30kbp。
29、具体的，步骤s1中，所述目标片段为基因或基因簇。
30、具体的，步骤s1中，所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇。
31、本发明的还提供了一种细菌基因组大尺度dna片段无痕插入的遗传操作方法，包括如下步骤：
32、s4、获得待插入目标片段；
33、s5、构建含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体，将待插入目标片段插入到操作位点上游同源臂与操作位点下游同源臂之间；得到包含插入同源重组元件的自杀质粒载体；转化工程菌，筛选出阳性株；所述自杀质粒载体上携带有条件性复制起点、正筛选标记、负筛选标记和可转移元件；所述插入同源重组元件的结构为插入同源重组元件的结构为操作位点上游同源臂-待插入目标片段-操作位点下游同源臂，所述操作位点为背景株中待插入目标片段的预定插入位点；
34、s6、将步骤s5得到阳性株与背景株进行结合转移，筛选出阳性株，即完成对目标片段的遗传操作。
35、优选的，步骤s5中，含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体的获得方式如下：扩增操作位点上游同源臂和操作位点下游同源臂，通过融合pcr将两者融合得到融合片段，利用环pcr方法将融合片段与线性化的自杀质粒骨架载体连接。
36、具体的，步骤s4中，获得待插入目标片段的方式为如下之一：
37、a、待插入目标片段分为待插入目标片段上游片段和待插入目标片段下游片段，分别扩增得到；或者将待插入目标片段可以分成多段，每段分别扩增获得；
38、b、采用long-range pcr扩增得到目标片段全长；
39、c、化学全合成。
40、具体的，步骤s5的操作为：将含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体线性化；利用dna无缝克隆技术将待插入目标片段上游片段、待插入目标片段下游片段和线性化的含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体连接；转化大肠杆菌χ7232，筛选出阳性菌株，提取重组自杀质粒，再次转化大肠杆菌χ7213，筛选出阳性插入突变株。
41、dna无缝克隆技术即基于dna无缝克隆(gibson assembly或golden gate等)技术的商品化试剂盒都可以；如，neb高保真dna大片段组装试剂盒，gibsoncloningkit和golden gate assembly kit(bsai-v2)等。
42、其中，步骤s5中，所述工程菌为大肠杆菌。
43、具体的，所述正筛选标记为抗生素标记。
44、优选的，所述抗生素标记cm、kan、spec、gm或amp。
45、其中，步所述自杀质粒载体上的负筛选标记为sacb、lacy或phes。
46、进一步的，步骤s2中，所述自杀质粒骨架载体为pre112。
47、其中，步骤s1中，所述目标片段长度为10～30kbp。
48、具体的，步骤s1中，所述目标片段为基因或基因簇。
49、具体的，步骤s1中，所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇。
50、本发明的还提供了一种细菌基因组大尺度dna片段带痕插入的遗传操作方法，包括如下步骤：
51、s7、获得背景株待插入位点两侧的上游同源臂和下游同源臂，通过环pcr的方式构建至线性化的大肠-酵母穿梭载体上，得到携带上游同源臂-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体；
52、s8、获得两端带有frt位点的抗性基因片段frt-抗性基因-frt；利用环pcr方法，将frt-抗性基因-frt与线性化的带上游同源臂-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体进行连接；得到携带上游同源臂-frt-抗性基因-frt-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体；
53、s9、将携带上游同源臂-frt-抗性基因-frt-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体线性化；获得待插入的目标片段；利用酵母转化介导的同源重组技术(tar)将前两者连接；得到携带上游同源臂-目标片段-frt-抗性基因-frt-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体；
54、s10、采用long-range pcr扩增上游同源臂-目标片段-frt-抗性基因-frt-下游同源臂片段，将其连接到线性化的自杀质粒骨架载体上；转化工程菌，获得阳性株；所述自杀质粒载体上携带有条件性复制起点、正筛选标记、负筛选标记和可转移元件；且正筛选标记与抗性基因不相同；
55、s11、将步骤s10获得阳性株与背景株进行结合转移，筛选出阳性插入突变株，向阳性株中转入表达frt位点特异性重组酶的载体，消除frt中间的抗性基因，即完成对目标片段的遗传操作。
56、其中，步骤s10中，所述工程菌为大肠杆菌。
57、具体的，所述正筛选标记为抗生素标记。
58、优选的，所述抗生素标记cm、kan、spec、gm或amp。
59、其中，步所述自杀质粒载体上的负筛选标记为sacb、lacy或phes。
60、进一步的，步骤s10中，所述自杀质粒骨架载体为pre112。
61、其中，步骤s9中，所述目标片段长度为10～30kbp。
62、具体的，步骤s9中，所述目标片段为基因或基因簇。
63、具体的，步骤s9中，所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇。
64、具体的，步骤s7中，所述酵母载体为pyes1l-ura。
65、具体的，步骤s8中，将frt-抗性基因-frt与线性化的带上游同源臂-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体进行连接，连接产物转入大肠杆菌er2566中，筛选出连接成功的阳性克隆。
66、特别的，步骤s9中，将携带上游同源臂-frt-抗性基因-frt-下游同源臂的大肠-酵母穿梭载体线性化；获得待插入的目标片段；利用酵母转化介导的同源重组技术(tar)将前两者连接；连接产物转入酵母mav203中，筛选出连接成功的阳性克隆。
67、具体的，步骤s10中，利用dna无缝克隆技术将线性化的自杀质粒骨架载体和上游同源臂-目标片段-frt-抗性基因-frt-下游同源臂片段进行连接，将连接产物电转入大肠杆菌χ7232，筛选出阳性克隆；提供阳性克隆的质粒，转入大肠杆菌χ7213中，筛选出阳性插入突变株；所述抗性基因与正筛选标记不同。
68、其中，步骤s11中，所述表达frt位点特异性重组酶的载体为pcp20质粒。
69、优选的，步骤s8中，所述抗性基因为抗cm、kan、spec、gm或amp的基因。
70、优选的，获得frt-抗性基因-frt的具体操作为：以pkd3质粒为模板扩增得到frt-cm-frt。
71、带痕插入时，当带有两个抗性基因的自杀质粒在和背景菌株做结合转移的时候，先用自杀质粒骨架上的抗性进行第一次筛选；然后再用蔗糖+同源臂中间的抗性进行第二次筛选，最后就可以得到目标基因+frt+抗性基因+frt整体定点插入了的突变株，最后往突变株中转入pcp20质粒，消除掉中间的抗性基因，最后就得到无抗性的，但是留有一个frt序列的无抗性插入突变株。
72、借助酵母的同源重组能力更容易构建目标大质粒；只有e.coliχ7213具有结合转移的能力。当目标序列过大时，可以先借助酵母进行上同源臂+目标片段+frt+抗性基因+frt+下同源臂的“零部件组装构造”，待前期“各个零件”组装完毕后，再一次性搬迁到pre112上，这样成功率较高。pre112再借助e.coliχ7213的结合转移能力，转移并整合到受体菌基因组中，最终实现大尺度的dna片段细菌基因组的定点插入。
73、本发明的有益效果：本发明提供了一种新的细菌基因组大尺度dna片段遗传操作技术，该技术能将大尺度的dna片段(10～30kbp)精准插入到细菌基因组中，且可以实现不带任何抗生素筛选标记的无痕插入突变。这种方法解决了一般性质粒较难承载和表达大尺度基因簇的问题，同时，基于该方法构建的大肠杆菌工程菌，用以获取某些病原菌株外膜表面的多糖抗原时，具有易培养、易提取、低成本和无生物安全风险等特点，因而具有较高的科研和应用价值。该技术的显著特征是通过结合转移的方式，将超大型的自杀质粒转入到细菌中；再通过同源重组的方式，将携带有目标基因簇的自杀质粒整合到细菌基因组中，最后通过正筛和负筛的方式，得到外源基因簇定点插入细菌基因组的突变菌株。该技术全程不需要引入scei限制性酶切位点和表达scei限制性内切酶，不需要使用λ-red重组酶。操作过程更为简便，成功率更高。
1.一种适用于细菌基因组大尺度dna片段遗传操作的载体，其特征在于：以自杀质粒载体为骨架载体，携带以下结构：条件性复制起点、同源重组元件、正筛选标记、负筛选标记和可转移元件；所述同源重组元件为缺失同源重组元件或插入同源重组元件；
2.根据权利要求1所述载体，其特征在于：所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇。
3.根据权利要求1所述载体，其特征在于：所述正筛选标记为抗生素标记；
4.根据权利要求1所述载体，其特征在于：所述骨架载体为pre112。
5.根据权利要求1所述载体，其特征在于：在带痕插入时，所述插入同源重组元件的结构为：操作位点上游同源臂-待插入目标片段-frt-抗性基因-frt-操作位点下游同源臂；且抗性基因与正筛选标记不相同。
6.含有权利要求1～5任一项所述载体的表达系统。
7.根据权利要求6所述表达系统，其特征在于，还包含有表达frt位点特异性重组酶的载体；
8.一种细菌基因组大尺度dna片段无痕缺失的遗传操作方法，其特征在于：包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：
10.一种细菌基因组大尺度dna片段无痕插入的遗传操作方法，其特征在于：包括如下步骤：
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于：步骤s4中，获得待插入目标片段的方式为如下之一：
12.根据权利要求10所述方法，其特征在于：步骤s5的操作为：将含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体线性化；利用dna无缝克隆技术将将待插入目标片段上游片段、待插入目标片段下游片段和线性化的含有操作位点上游同源臂-操作位点下游同源臂的自杀质粒载体连接；转化大肠杆菌χ7232，筛选出阳性菌株，提取重组自杀质粒，再次转化大肠杆菌χ7213，筛选出阳性株。
13.一种细菌基因组大尺度dna片段带痕插入的遗传操作方法，其特征在于：包括如下步骤：
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于：具备如下特征中的至少一个：
15.根据权利要求8～14任一项所述方法，其特征在于：具备如下特征中的至少一个：
16.根据权利要求15所述方法，其特征在于：所述基因簇为大肠杆菌o抗原多糖基因簇、鼠伤寒沙门菌(s.typhimurium)o抗原多糖基因簇、肠炎沙门菌(s.enteritidis)o抗原多糖基因簇、副伤寒沙门菌(s.paratyphi a)o抗原多糖基因簇、大肠杆菌eca基因簇、大肠杆菌ca基因簇或伤寒沙门菌(s.typhi)vi荚膜多糖基因簇；
