本发明属于生物制药，尤其涉及一种治疗苯丙酮尿症的非病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、苯丙酮尿症(pku)是一种常染色体隐性遗传代谢性疾病，特征是苯丙氨酸羟化酶(pah)的基因发生突变，使所述基因失去功能。pah是将氨基酸苯丙氨酸(phe)代谢为氨基酸络氨酸所必需的。当pah活性降低时，苯丙氨酸会积累并转化为苯丙氨酸盐。如果不治疗，pku会导致智力迟钝，癫痫发作和其他严重的医学问题。目前，这种疾病无法治愈，护理标准是通过饮食管理，尽量减少含有大量蛋白质的食物。
2、大多数的pku由肝苯丙氨酸羟化酶(pah)缺乏导致。pah是一种多聚体肝酶，其在分子氧和催化量的四氢生物蝶呤(bh4)的情况下催化苯丙氨酸(phe)羟基化为络氨酸。在没有表达足够pah的情况下，血液中的苯丙氨酸水平增高，导致高苯丙氨酸血症以及对pku患者的有害副作用。pa h活性降低或缺乏可能会导致缺乏络氨酸及其下游产物，包括黑色素，1-甲状腺素和儿茶酚胺神经递质，其包括多巴胺。
3、pku可能由pah中的突变和/或pah辅因子(bh4)合成或再生中的缺陷导致。已经证明多种pah突变将影响内质网中的蛋白质折叠，由于蛋白质结构中减弱或在很大程度上消除酶催化活性的小缺失和错义突变，这将导致降解和/或聚合加速。
4、当前，对phe和bh4补充的终生饮食限制是对pku仅有的两种可用治疗选择，其中早期治疗干预对于确保受影响婴儿的最佳临床结局而言至关重要。然而，昂贵的药物和特殊的低蛋白食品给患者带来沉重负担，尤其是在私人健康保险未完全涵盖这些产品的情况下，其可能导致营养不良，社会心理或神经认知并发症。此外，bh4疗法主要对于与bh4生物合成缺陷相关的轻度高苯丙氨酸血症有效，然而仅有20-30％的轻度或经典pku患者对此有反应。因此，迫切需要的新pku治疗方式，以替代繁重的phe限制饮食。因此，需要开发一种用于治疗苯丙酮尿症的替代方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗苯丙酮尿症的非病毒载体及其制备方法和应用，应用静脉注射将非病毒载体递送体内，通过在肝脏中特异性矫正编辑苯丙氨酸羟化酶(pah)，解决由于基因突变导致的pah功能缺陷，恢复pah催化丙氨酸转化为酪氨酸的功能，从而让pah活性减弱或丧失的pku患者得到个性化基因治疗。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种治疗苯丙酮尿症的非病毒载体，所述非病毒载体包括脂质类载体和编辑pah基因表达的核酸分子；
4、所述脂质类载体包括阳离子脂质和辅助脂质，所述辅助脂质包括ph敏感脂质成分和促免疫逃逸脂质成分；
5、所述编辑pah基因表达的核酸分子包括dna、sirna、mrna或sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.1所示。
6、优选的，所述阳离子脂质包括dlin-mc3-dma、alc-0315、sm-102和atx-126中的一种或多种。
7、优选的，所述ph敏感脂质成分为二油酰基磷脂酰乙醇胺，所述促免疫逃逸脂质成分为二硬脂酰磷脂酰胆碱和/或dspe-peg2000。
8、优选的，所述阳离子脂质：ph敏感脂质成分的摩尔比为1:(0.1～10)，所述促免疫逃逸脂质成分的用量不超过脂质类载体质量的20％。
9、优选的，所述辅助脂质还包括膜流动性调节脂质成分，所述膜流动性调节脂质成分为dspc和/或胆固醇，所述阳离子脂质：膜流动性调节脂质成分的摩尔比为1:(0.1～5)。
10、优选的，所述非病毒载体还包括辅助分子，所述辅助分子包括枸橼酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠中的一种或多种。
11、本发明还提供了所述的治疗苯丙酮尿症的非病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
12、1)将阳离子脂质及辅助脂质溶解于溶剂，得到载体材料溶液；
13、2)将载体材料溶液的溶剂蒸除，得到脂质薄膜；
14、3)将脂质薄膜干燥后与水或非离子缓冲液进行水合，然后依次经超声分散、搅拌、微孔滤膜过滤，得到脂质类载体溶液；
15、4)将编辑pah基因表达的核酸分子与脂质类载体溶液混合后于10～30℃下孵育20～60min，使脂质类载体对所述编辑pah基因表达的核酸分子进行包裹或装载得到治疗苯丙酮尿症的非病毒载体。
16、优选的，所述溶剂为三氯甲烷；所述非离子缓冲液为浓度10～40mmol/l的hepes溶液；
17、所述超声分散的条件为于40～60℃水浴下超声处理1～20min；所述搅拌的条件为于40～60℃水浴下磁力搅拌；所述微孔滤膜的孔径为≤0.22μm。
18、优选的，步骤4)混合时所述核酸分子中的氮元素与脂质类载体中的磷元素的摩尔比为1～10:1；
19、步骤4)所述孵育后加入终浓度为1～150mmol/l的辅助分子，然后于10～30℃下继续进行孵育。
20、本发明还提供了所述的非病毒载体或所述的制备方法制备得到的非病毒载体在制备治疗苯丙酮尿症药物中的应用。
21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22、本发明利用脂质类纳米载体包裹或装载矫正编辑苯丙氨酸羟化酶(pah)基因的基因编辑载体等核酸类分子，构建了一种针对苯丙氨酸羟化酶(pah)基因阳性细胞具有高度特异性的非病毒载体，其中的脂质类载体是利用阳离子脂质与辅助脂质成分构成的阳离子脂质体，通过免疫逃逸、ph响应机制可以使核酸类药物高效的递送至靶细胞(c.835t>c纯合huh-7细胞)，并将核酸类药物释放于靶细胞内，从而保证其药物活性在递送中不遭到破坏，其所递送的核酸类分子通过靶向矫正编辑c.835t>c纯合huh-7细胞，矫正人肝细胞中pah变体，明显恢复苯丙氨酸羟化酶水平，可以显著提高治疗苯丙酮尿症等遗传性疾病的效果。
23、本发明制备的非病毒载体粒径均匀、体系稳定，适用范围广，可以包裹或负载基因编辑药物，能将dna、sirna、mrna等核酸类分子递送至细胞中，且药物包封率高，针对肝细胞具有较高的药物递送效率。通过筛选脂质体成分及其之间的比例，解决了阳离子脂质体针对向细胞递送核酸类药物时效率不稳定的问题，将核酸类药物高效递送至靶细胞并发挥作用。同时兼顾了载药稳定性与ph响应功能，改善了脂质体在细胞内的降解情况，提高了核酸类药物在细胞内的释放效率。
24、本发明的基因表达载体制备方法简单、sgrna靶向性好，碱基编辑系统的编辑效率高。本发明的非病毒载体发挥碱基编辑系统快速、简便、高效、特异性编辑矫正人肝细胞中pah变体的优势，结合阳离子脂质体，能够精确靶向矫正编辑人肝细胞中pah变体，有效恢复苯丙氨酸羟化酶水平，即显示出治疗遗传病的优效性，将为靶向治疗苯丙酮尿症等遗传性疾病提供有效的药物治疗途径。
1.一种治疗苯丙酮尿症的非病毒载体，其特征在于，所述非病毒载体包括脂质类载体和编辑pah基因表达的核酸分子；
2.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述阳离子脂质包括dlin-mc3-dma、alc-0315、sm-102和atx-126中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述ph敏感脂质成分为二油酰基磷脂酰乙醇胺，所述促免疫逃逸脂质成分为二硬脂酰磷脂酰胆碱和/或dspe-peg2000。
4.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述阳离子脂质：ph敏感脂质成分的摩尔比为1:(0.1～10)，所述促免疫逃逸脂质成分的用量不超过脂质类载体质量的20％。
5.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述辅助脂质还包括膜流动性调节脂质成分，所述膜流动性调节脂质成分为dspc和/或胆固醇，所述阳离子脂质：膜流动性调节脂质成分的摩尔比为1:(0.1～5)。
6.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述非病毒载体还包括辅助分子，所述辅助分子包括枸橼酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠中的一种或多种。
7.权利要求1～6任意一项所述的治疗苯丙酮尿症的非病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为三氯甲烷；所述非离子缓冲液为浓度10～40mmol/l的hepes溶液；
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤4)混合时所述核酸分子中的氮元素与脂质类载体中的磷元素的摩尔比为1～10:1；
10.权利要求1～6任意一项所述的非病毒载体或权利要求7～9任意一项所述的制备方法制备得到的非病毒载体在制备治疗苯丙酮尿症药物中的应用。
