本发明属于新型纳米材料制备，具体涉及一种自组装型铜纳米簇的制备方法及其和应用。
背景技术：
1、金属纳米簇材料是一类核壳结构且尺寸小于2nm的超小金属纳米颗粒，其核心通常由几个到几百个金属原子组成，具有独特的类分子电子结构和独特的光学和电化学性能，并且具有低毒、生物相容性好等特点，因此在发光、催化、传感、生物医学等领域受到了广泛关注。金属纳米簇的性能往往与材料的颗粒尺寸、聚集态结构等密切相关。相对于单分散的纳米簇，组装后的金属纳米簇具有优异的光学性能、良好的稳定性等优点，适用于电化学发光、传感器器件等应用领域。另外，相对于贵金属纳米簇(如au和ag)，铜纳米簇具有价格相对低廉、成本较低、储量丰富等优势，适合于大规模应用。
2、虽然铜纳米簇在诸多领域有着良好的应用前景，但铜纳米簇的合成方法较少，合成条件较苛刻，不仅制备繁琐或需要升温等额外操作，且合成出来的产物稳定性较差不适合长期储存，使得铜纳米簇的规模化生产面临挑战。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提出了一种全新的铜纳米簇的制备方法，并且是自组装型铜纳米簇的制备方法，解决现有技术中铜纳米簇或者是自组装型铜纳米簇合成方法少的问题，并且具有制备过程简便，可大量制备的优点。
2、本发明还提供一种自组装型铜纳米簇和应用，本发明制备出的自组装型铜纳米簇是一种新型纳米材料，因其自组装行为的存在，显著改变了材料的结构，并有效改善了材料的性能。
3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种自组装型铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将铜盐溶于有机溶剂，超声形成铜盐溶液溶液；
5、(2)将4,6-二甲基巯基嘧啶溶于有机溶剂，超声形成4,6-二甲基巯基嘧啶溶液；
6、(3)将4,6-二甲基巯基嘧啶溶液在加到铜盐溶液中，搅拌得混合溶液；
7、(4)将混合溶液离心弃上清液，洗涤沉淀得到自组装型铜纳米簇。
8、其中，步骤(1)所述铜盐为硝酸铜、硫酸铜、氯化铜或碳酸铜。
9、作为优选，步骤(1)所述铜盐为三水合硝酸铜。
10、其中，步骤(1)中将10～60mg铜盐粉末与5ml有机溶剂混合，形成铜盐溶液。
11、作为优选，将30mg三水合硝酸铜粉末与5ml乙醇混合，形成硝酸铜乙醇溶液，备用。
12、其中，步骤(2)中将8～58mg 4,6-二甲基巯基嘧啶粉末与5ml有机溶剂混合，形成4,6-二甲基巯基嘧啶溶液。
13、作为优选，采用28mg 4,6-二甲基巯基嘧啶粉末与5ml乙醇混合，形成4,6-二甲基巯基嘧啶乙醇溶液。
14、其中，步骤(1)和(2)中有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺中的任意一种。优选为乙醇。
15、其中，步骤(3)中将4,6-二甲基巯基嘧啶溶液在磁力搅拌下均匀加到铜盐溶液溶液中，继续磁力搅拌3～20min，得混合溶液。
16、作为优选，采用将4,6-二甲基巯基嘧啶乙醇溶液在磁力搅拌下均匀加到硝酸铜乙醇溶液中，磁力搅拌10min，得混合溶液。
17、作为优选，所述混合溶液在4500rpm条件下离心5min，弃上清液，并用乙醇洗涤沉淀。
18、其中，步骤(4)所述混合溶液在1000～6000rpm条件下离心5min，弃上清液，洗涤沉淀，得到自组装铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)。其中，所述向沉淀中加入5～30ml水，磁力搅拌10～80min得到自组装铜纳米簇悬浮液。
19、作为优选，采用向沉淀中加入10ml水，磁力搅拌10～80min得到自组装铜纳米簇悬浮液。更优选地，向沉淀中加入10ml水，磁力搅拌60min。
20、本发明所述自组装型铜纳米簇的制备方法所制备的自组装铜纳米簇。
21、本发明所述的自组装型铜纳米簇的制备方法所制备的自组装型铜纳米簇在催化、荧光(成像)传感、发光二极管、光电转换材料和生物医药中的应用。
22、作为优选，所述自组装型铜纳米簇在制备检测碱性磷酸酶的电化学发光传感器中的应用。
23、其中，所述电化学发光传感器由二氧化锰纳米片修饰到以电化学发光试剂自组装型铜纳米簇作为基底膜层的电极上形成。本发明中将碱性磷酸酶(alp)先与底物l-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(aap)发生催化反应，产生大量中间物抗坏血酸(aa)；随后通过本发明的电化学发光传感器对该中间物aa进行定量检测，最终达到间接定量检测碱性磷酸酶的目的。本发明中以自组装型铜纳米簇作为电化学发光试剂，三乙胺作为电化学发光反应的共反应剂其中自组装型铜纳米簇具有毒性低、稳定性好、电化学发光强度高等优势，并且具有制备过程简易，可大量制备的优点。本发明的传感器系统进行人血清中碱性磷酸酶的定量检测其特异性好、灵敏度高、线性范围宽，且具有成本较低的优势。利用本发明的自组装型铜纳米簇制备的电化学传感器灵敏度高，解决了现有的商品化碱性磷酸酶检测试剂盒(分光光度法，最低检测限为3u/l)灵敏度较低的问题。
24、作为优选，本发明所述的测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
25、(1)将工作电极进行抛光后，超声清洗；
26、(2)取sa-dmpm-cuncs悬浮液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥；
27、(3)向上述电极表面滴加二氧化锰纳米片溶液，室温下静置干燥，得到测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器。
28、更为优选地，测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器的制备方法，按如下步骤制备：
29、(1)将工作电极依次用0.3μm、0.05μm al2o3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗2～10min；
30、(2)取2～20μl 0.1～1mg/ml sa-dmpm-cuncs悬浮液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥；
31、(3)向上述电极表面滴加2～20μl 0.01～1mg/ml二氧化锰纳米片溶液，室温下静置干燥，得到测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器。
32、最优选地，测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器的制备方法，按如下步骤制备：
33、(1)将工作电极依次用0.3μm、0.05μm al2o3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗5min；；
34、(2)取5μl 0.24mg/ml sa-dmpm-cuncs悬浮液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥；
35、(3)向上述电极表面滴加5μl 0.1mg/ml二氧化锰纳米片溶液，室温下静置干燥，得到测定aa和碱性磷酸酶的电化学发光传感器。
36、其中，所述定量碱性磷酸酶的步骤如下：
37、(1)用tris-hcl缓冲溶液配制l-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(aap)与碱性磷酸酶的混合溶液；
38、(2)将上述溶液混匀并于37℃反应，得到含有aa的溶液；
39、(3)将权利要求1所述的电化学发光传感器置于所述(2)得到的含有aa的溶液中室温反应，取出后清洗吹干，备用；
40、(4)将步骤(3)中反应后的电化学发光传感器进行ecl信号强度的采集，通过电化学发光信号的恢复值计算相应的碱性磷酸酶浓度。
41、其中，步骤(3)中反应后的电化学发光传感器连接至ecl仪器，以ph＝6～10的pbs溶液为电解质和10～150μm的三乙胺为共反应剂，进行ecl信号强度的采集，通过电化学发光信号的恢复值计算相应的碱性磷酸酶浓度。
42、本发明所述的测定碱性磷酸酶的电化学发光传感器在制备定量检测碱性磷酸酶工具或试剂中的应用。
43、作为优选，所述的定量检测碱性磷酸酶的应用，其检测操作步骤如下：
44、(1)用ph＝7～10的tris-hcl缓冲溶液配制l-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(aap)和碱性磷酸酶的混合液；
45、(2)将上述溶液混匀并于37℃反应10～60min，得到含有aa的溶液；
46、(3)将电化学发光传感器置于所述(2)得到的溶液中室温反应1～10min，取出用水清洗并用氮气吹干，备用。
47、(4)将步骤(3)中反应后的电化学发光传感器连接至ecl仪器，进行ecl信号强度的采集，通过电化学发光信号的恢复值计算相应的碱性磷酸酶浓度。
48、更为优选地，所述的定量检测碱性磷酸酶的检测按如下步骤：
49、(1)用ph＝7～10的tris-hcl缓冲溶液配制含有25mm aap和不同浓度碱性磷酸酶的混合液；
50、(2)将上述溶液混匀并于37℃反应10～60min，得到含有aa的溶液；
51、(3)将电化学发光传感器置于所述(2)得到的溶液中室温反应1～10min，然后取出用水清洗并用氮气吹干，备用。
52、(4)将步骤(3)中反应后的电化学发光传感器连接至ecl仪器，以ph＝6～10的pbs溶液为电解质和10～150μm的三乙胺为共反应剂，进行ecl信号强度的采集，通过电化学发光信号的恢复值计算相应的碱性磷酸酶浓度。
53、最优选地，所述的定量检测碱性磷酸酶的检测按如下步骤：
54、(1)用ph＝8的tris-hcl缓冲溶液配制含有25mm aap和不同浓度碱性磷酸酶的混合液；
55、(2)将上述溶液混匀并于37℃反应30min，得到含有aa的溶液；
56、(3)将电化学发光传感器置于所述(2)得到的溶液中室温反应3min，取出用水清洗并用氮气吹干，备用。
57、(4)将步骤(3)中反应后的电化学发光传感器连接至ecl仪器，以ph＝7.4的pbs溶液为电解质和75μm的三乙胺为共反应剂，进行ecl信号强度的采集，通过电化学发光信号的恢复值计算相应的碱性磷酸酶浓度。
58、其中，进行ecl信号强度的采集时的光电倍增高压(pmt)为300～800v，测试范围为0.2-1.3v。
59、作为优选，进行ecl信号强度的采集时的pmt＝500v，测试范围为0.2-1.3v。
60、本发明制备的电化学传感器采用自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)作为电化学发光试剂时，使用二氧化锰纳米片作为发光剂sa-dmpm-cuncs的ecl信号猝灭剂，使用选三乙胺作为电化学发光反应的共反应剂，通过电化学发光工作站检测电化学发光信号。
61、本发明实际还提供了一种电化学发光组成系统，包括自组装型铜纳米簇作为电化学发光试剂，二氧化锰纳米片作为发光剂sa-dmpm-cuncs的ecl信号猝灭剂，三乙胺作为电化学发光反应的共反应剂，以及三电极体系。
62、作为优选，所述电化学发光组成系统包括sa-dmpm-cuncs作为电化学发光剂，二氧化锰纳米片作为发光剂sa-dmpm-cuncs的ecl信号猝灭剂，三乙胺作为电化学发光反应的共反应剂，玻碳电极作为工作电极，银-氯化银电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极。
63、本发明中alp先与底物aap发生催化反应，产生大量中间物aa；随后通过本发明的电化学发光传感器对该中间物aa进行定量检测，最终达到间接定量检测碱性磷酸酶的目的。具体检测alp时，将alp与底物aap发生催化反应，产生大量中间物aa；二氧化锰纳米片作为发光剂sa-dmpm-cuncs的ecl信号猝灭剂，首先猝灭传感器的ecl信号，继而在中间物aa的作用下发生氧化还原反应生成mn2+，从而恢复传感器的ecl信号；由于aa能够剂量依赖地还原二氧化锰纳米，因此alp的浓度与电化学发光信号恢复值呈线性关系，实现alp的定量检测。
64、本发明主要是针对目前不容易制备出自组装型铜纳米簇或者制备方法繁琐提出的一种全新的制备方法。本发明制备出的自组装型铜纳米簇，虽然属于铜纳米簇，但是其是新型性能更好的自组装型铜纳米簇材料，本发明自组装型铜纳米簇为4,6-二甲基巯基嘧啶(dmpm)作为配体制备的自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)，其自组装特性可以调控、提高材料性能，可以替代传统的铜纳米簇材料应用于催化、荧光(成像)传感、发光二极管、电化学传感、光电转换材料和生物医药等领域，并且合成方法新颖，且得到的材料稳定性高，生物相容性好。
65、目前，自组装是设计理想的构建块以优化纳米簇性能的有效策略之一。适当的自组装连接纳米簇可以产生有序的结构，这将有利于改善电子/电荷转移，抑制纳米簇配体的运动和旋转，减少纳米簇的氧化。分子间相互作用，特别是涉及π-π堆叠的相互作用，对于调节分子聚集和材料性质至关重要。由于嘧啶类衍生物具有形成π-π堆叠组合体的强烈倾向，及优异的电子传递性质促使我们将其用作合成cuncs的配体，以提高其稳定性和电子传输性能。
66、本发明采用全新的方法，成功合成了具有稳定性高、荧光量子效率和电化学发光效率显著的铜纳米簇。本发明自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)自组装机制如下：自组装前的铜纳米簇(dmpm-cuncs)在h2o中实现了表面基序重建，导致相对cu(i)含量增加，从而产生强的簇间亲铜cu(i)···cu(i)相互作用，促进了cuncs核心的自组装。另一方面，dmpm配体的π-π堆叠和疏水作用导致了配体的自组装，进一步使cuncs相互靠近。这两个因素都有助于在水溶液中dmpm-cuncs转变为有序的sa-dmpm-cuncs。
67、本发明首次提出了以4,6-二甲基-2-巯基嘧啶(dmpm)小共轭分子为配体，在室温条件下，简便合成了具有稳定性高、荧光量子效率和电化学发光效率显著的sa-dmpm-cuncs。本发明全新的制备方法不仅制备简便，不需要特定的反应容器及升温等附加条件，在常压室温状态下即可简便快速合成。
68、有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：
69、1、本发明制备出一种新型自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)，透射电子显微镜图片表明sa-dmpm-cuncs形貌呈纳米片状，且纳米片上可见单颗粒状团簇的规则排列，区别于传统的单分散的团簇形貌，故为自组装型。
70、2、本发明一种全新的自组装型铜纳米簇的制备方法，解决现有技术中自组装型铜纳米簇合成方法少、步骤繁琐等问题，并具有制备过程简易，可大量制备的优点。
71、3、本发明制备出的自组装型铜纳米簇，是一种新型纳米材料，具有稳定性好、荧光量子效率高(39.3％)和电化学发光效率高(20％)等优点，显著优于传统的铜纳米簇性能，本发明所制备的自组装型铜纳米簇因组装行为的存在，显著改变了材料的结构，有效提高了材料的性能，所以在催化、荧光(成像)传感、发光二极管、电化学传感、光电转换材料和生物医药等相关领域都具有重要的应用价值。
72、4、本发明提供了制备的自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)材料作为电化学发光反应发光剂的新应用，其作为电化学发光发光剂稳定性好、电化学发光效率高、制备过程简便，可大量制备，可以有效应用到电化学发光传感器中，实现高灵敏度传感。
73、5、本发明由自组装型铜纳米簇(sa-dmpm-cuncs)材料作为电化学发光反应发光剂电化学发光传感器应用于检测血清内的碱性磷酸酶，即不需要对样品进行复杂处理，又避免了使用昂贵仪器、操作繁琐等问题。同时本发明针对目标分析物的alp特殊性设计了一种“on-off-on”型的电化学发光传感器，本发明传感器成功地实现了人血清中alp的定量检测，并且特异性好、灵敏度高、线性范围宽，且具有成本价低，使用方便等优势。
1.一种自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述铜盐为硝酸铜、硫酸铜、氯化铜或碳酸铜。
3.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述铜盐为三水合硝酸铜。
4.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将10～60mg铜盐粉末与5ml有机溶剂混合，形成铜盐溶液；步骤(2)中将8～58mg 4,6-二甲基巯基嘧啶粉末与5ml有机溶剂混合，形成4,6-二甲基巯基嘧啶溶液。
5.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺中的任意一种。
6.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将4,6-二甲基巯基嘧啶溶液在磁力搅拌下均匀加到铜盐溶液溶液中，继续磁力搅拌3～20min，得混合溶液。
7.根据权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述混合溶液在1000～6000rpm条件下离心5min，弃上清液，洗涤沉淀，得到自组装前的铜纳米簇(dmpm-cuncs)；步骤(5)所述向沉淀中加入水，磁力搅拌10～80min得到自组装铜纳米簇悬浮液(sa-dmpm-cuncs)。
8.一种权利要求1所述自组装型铜纳米簇的制备方法所制备的自组装铜纳米簇。
9.一种权利要求1所述的自组装型铜纳米簇的制备方法所制备的自组装型铜纳米簇在催化、荧光(成像)传感、发光二极管、光电转换材料和生物医药中的应用。
10.一种权利要求1所述的自组装型铜纳米簇的制备方法所制备的自组装型铜纳米簇优选在制备检测碱性磷酸酶的电化学发光传感器中的应用。
