本发明涉及病毒检测，尤其涉及一种基于raa-crispr/cas13a-lfd检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法。
背景技术：
1、鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)是由鸡传染性法囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)引起的主要感染雏鸡的一种急性、高度接触性和免疫抑制性传染病。该病主要感染3-6周龄以内的鸡群，主要侵害雏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，从而引起免疫抑制，进而引起疫苗免疫失败或继发其他病毒性、细菌性疾病，严重的可以导致鸡群大量死亡，给养禽业带来巨大的经济损失。ibdv有两种血清型，血清1型包括所有致病毒株，只有血清型i型对鸡具有致病性，血清2型既不致病亦不产生对血清1型的保护。该病毒主要随病鸡的粪便排出，然后污染饲料、水和周围的环境，进而使同鸡舍的鸡群被感染，感染传播率极高，能在发病鸡群、隐性感染鸡群、易感染鸡群之间迅速传播。因此，做好早期预防对降低该疾病的传播风险，及时控制疫情至关重要，而ibdv的快速检测在促进早期防控方面发挥着关键作用。
2、目前，ibdv的检测方法有多种，如病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(pcr)、实时荧光定量pcr(qpcr)、环介导等温扩增(lamp)和酶联免疫吸附试验(elisa)等。虽然常用的病毒分离鉴定方法相对准确，但操作繁琐，对培养条件要求高。elisa方法特异性好，但敏感性较低，操作复杂。lamp可以在60-65℃恒温下反应，具有很强的特异性和高扩增效率，但引物设计较为复杂。pcr和qpcr方法虽然具有高灵敏度，但它们往往依赖昂贵的设备和专业人员，反应时间长，操作步骤繁琐，往往容易出现非特异性反应，都不适合ibdv的现场快速诊断。因此，发展一种快速、操作简便、高特异性、高灵敏度的鸡传染性法氏囊病病毒的快速检测方法，对早期防治鸡传染性法氏囊病具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法存在的耗时长、特异性差、灵敏度低以及不适合基层和现场检测的问题，本发明提供一种基于raa-crispr/cas13a-lfd检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，利用本发明提供的引物可实现鸡传染性法氏囊病病毒的可视化检测，且检测准确度高，用时短，特异性好、灵敏度高，为快速、简便且准确地诊断ibdv提供了基础，满足基层和现场检测的需求。
2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种基于raa-crispr/cas13a-lfd检测鸡传染性法氏囊病病毒的核酸分子组合物，包括引物对和和特异crrna，所述引物对的序列如下：
4、上游引物ibdv-raa-f:5′-tctgcaacagccaacatcaacgacaaaatt-3′(seq id no:1)，
5、下游引物ibdv-raa-r:5′-tgctgtcacatgtggctaccatttttgggt c-3′(seq id no:2)；
6、所述特异crrna的序列为：
7、ibdv-crrna:5′-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaaccauaugauguggguaagcugaggacggu-3′(seq id no:3)。
8、相对于现有技术，本发明提供的检测鸡传染性法氏囊病病毒的核酸分子组合物，将raa、crispr/cas13a和横向流动试纸条(lfd)相结合，根据ibdv的vp2基因的保守序列设计了raa引物和特异crrna，利用该引物和特异crrna可准确检测出鸡传染性法氏囊病病毒，且与马立克氏病毒(mdv)、禽白血病病毒(alv)、鸡新城疫病毒(ndv)、鸡贫血病毒(cav)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)等均无交叉扩增反应，特异性强；对ibdv的最低检测限为100copies/μl(10-2fg/μl)，能够实现对ibdv的早期快速诊断，同时，检测的准确度高，临床检测符合率达到98.33％，检测时间明显缩短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速可视化检测ibdv的目的，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用，能够较好地满足临床检测需求，对ibdv的疫病防控具有重要意义。
9、进一步地，所述上游引物ibdv-raa-f的5′端设有t7启动子。
10、t7启动子的序列为：gaaattaatacgactcactataggg。
11、第二方面，本发明还提供了上述任一项所述的核酸分子组合物在非诊断性检测鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
12、第三方面，本发明还提供了一种用于检测鸡传染性法氏囊病病毒的试剂盒，包含上述任一项所述的核酸分子组合物。
13、优选的，所述试剂盒还包括cas13a蛋白和用于raa扩增的试剂或试剂盒。
14、第四方面，本发明还提供了上述试剂盒在非诊断性检测鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
15、第五方面，本发明还提供利用上述试剂盒检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，具体操作为：
16、s1，提取鸡传染性法氏囊病病毒的基因组为模板，用所述试剂盒的上游引物ibdv-raa-f和下游引物ibdv-raa-r组成的引物对进行raa扩增；
17、s2，将raa扩增产物加入crispr-cas13a体系中进行孵育；所述crispr-cas13a体系包括所述试剂盒中的特异crrna；
18、s3，利用lfd对crispr-cas13a的孵育产物进行检测。
19、上述检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，可用于鸡传染性法氏囊病病毒的临床快速诊断和防控，可以大大减小对ibdv感染错漏诊断问题的出现，对于净化ibdv具有十分重要的意义。
20、本发明提供的raa-crispr/cas13a-lfd方法的检测原理如图1所示。从样本中提取核酸，通过raa反应快速扩增后获得带有t7启动子的dna分子，利用t7体外转录系统获得大量含有目标序列的单链rna(ssrna)，当存在目标序列时，目标rna与crrna-cas13a蛋白复合体特异性结合，激活cas13a蛋白的“附带切割”活性，切割6-fam-biotin报告分子，报告分子fam端与标记有fam抗体的胶体金颗粒的复合物被二抗结合，t线出现，为阳性；当不存在目标序列时，cas13a不会被激活，不会实行剪切功能，c线处链霉亲和素捕捉报告分子与标记有fam抗体的胶体金颗粒的复合物的biotin端，仅出现c线，为阴性。
21、优选的，s1中，所述raa扩增的体系包括以下试剂及用量：基础缓冲液a 32.9μl，上游引物和下游引物各2.0μl，cdna模板2μl，基础缓冲液b2.5μl，纯化水补足至50μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，dna模板的浓度为115.4μg/ml。
22、进一步地，上述基础缓冲液a为用于raa扩增的a buffer，主要成分为聚乙二醇；所述基础缓冲液b为用于raa扩增的b buffer，主要成分为mg2+。
23、优选的，s2中，所述crispr-cas13a体系包括以下试剂及用量：25mmol/l ntpbuffer mix 4μl，40u/μl rnase抑制剂2μl，50nmol/l cas13a 4μl，25ng/μl crrna 2μl，rna双标记探针2μl，5000u/ml t7 rna polymerase mix 1μl，1mol/l氯化镁溶液0.5μl，1mol/l hepes缓冲液1μl，无酶无菌水28.5μl和raa扩增产物5μl。
24、上述优选的反应条件可进一步提高鸡传染性法氏囊病病毒的检测效率。
25、优选的，s1中，所述raa扩增的反应温度为37℃，反应时间为20min。
26、优选的，s2中，所述孵育的温度为37℃，孵育的时间为20min。
27、进一步地，利用lfd对crispr-cas13a孵育产物进行检测时，lfd出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；lfd的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。
28、本发明根据鸡传染性法氏囊病病毒的相对保守序列设计特异的crrna和raa引物，当crrna识别到目标序列，激活cas13a蛋白对报告探针进行切割，随着采用横向流动试纸条(lfd)读取检测结果，实现了简便、高效、可视化检测ibdv的目的。本发明提供的raa-crispr/cas13a-lfd方法在37℃条件下，反应40min，即可实现目的基因的有效扩增，试验结果通过lfd肉眼观察即可判定；特异性良好，与马立克氏病毒(mdv)、禽白血病病毒(alv)、鸡新城疫病毒(ndv)、鸡贫血病毒(cav)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)无交叉反应；最低检测限可达到100copies/μl；具有良好的重复性与稳定性；临床检测符合率达到98.33％。综上所述，本发明建立了一种简便、高效、准确、结果可视化的ibdv检测方法，可用于鸡传染性法氏囊病(ibd)的临床快速诊断和防控。
1.一种基于raa-crispr/cas13a-lfd检测鸡传染性法氏囊病病毒的核酸分子组合物，其特征在于，包括引物对和特异crrna，所述引物对的序列如下：
2.权利要求1所述的核酸分子组合物在非诊断性检测鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
3.一种用于检测鸡传染性法氏囊病病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸分子组合物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas13a蛋白和用于raa扩增的试剂或试剂盒。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在非诊断性检测鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
6.利用权利要求3或4所述的试剂盒检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，其特征在于，具体操作为：
7.如权利要求6所述的检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，其特征在于：s1中，所述raa扩增的体系包括以下试剂及用量：基础缓冲液a 32.9μl，上游引物和下游引物各2.0μl，cdna模板2μl，基础缓冲液b 2.5μl，纯化水补足至50μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，dna模板的浓度为115.4μg/ml。
8.如权利要求6所述的检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，其特征在于：s2中，所述crispr-cas13a体系包括以下试剂及用量：25mmol/l ntp buffer mix 4μl，40u/μl rnase抑制剂2μl，50nmol/l cas13a 4μl，25ng/μlcrrna 2μl，rna双标记探针2μl，5000u/ml t7rna polymerase mix 1μl，1mol/l氯化镁溶液0.5μl，1mol/l hepes缓冲液1μl，无酶无菌水28.5μl和raa扩增产物5μl。
9.如权利要求6所述的检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，其特征在于：s1中，所述raa扩增的反应温度为37℃，反应时间为20min。
10.如权利要求6所述的检测鸡传染性法氏囊病病毒的方法，其特征在于：s2中，所述孵育的温度为37℃，孵育的时间为20min。
