本发明涉及中药领域，具体涉及一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方领域。
背景技术：
1、糖尿病（diabetes mellitus, dm）是一种慢性进行性内分泌代谢性疾病，随着世界经济的不断发展和人们生活水平的日益改善，我国糖尿病的患病率也呈现了逐年增高的态势。随着糖尿病病程的逐年增长，会引发诸如肝脏、肾脏、心脏等一系列的并发症，在众多并发症中，导致糖尿病患者死亡的主要原因之一就是大血管病变，约占糖尿病相关死因的70%-80%。因此，预防和延缓血管并发症已成为一个亟待解决的问题。导致糖尿病血管并发症的机制十分复杂，其中内皮损伤被认为是糖尿病大血管并发症的早期指标。血管内皮细胞是血管内环境的主要组成之一，当血管内皮细胞出现障碍时，会引发多种心血管性疾病的产生。最近的研究表明，高浓度的葡萄糖可以促进细胞粘附分子（cam）的过度表达，包括内皮细胞表面的细胞内粘附分子1（icam-1）、血管粘附分子1（vcam-1），并与循环免疫细胞结合，导致白细胞募集，从而加剧内皮功能障碍。
2、现代医学发现糖脂代谢紊乱及其引发的血管内皮损伤是糖尿病血管并发症的主要因素和病理基础。血糖升高、血脂异常等危险因素会引发巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬大量脂质形成泡沫细胞，加重血管的炎症反应，导致血管内皮损伤和内皮功能障碍。英国前瞻性研究（ukpds）和美国的糖尿病并发症与控制试验（dccp）也证实了高血糖是糖尿病慢性并发症的主要因素。方朝晖等[17]对35例dchd患者采用益气活血养阴法进行治疗，结果显示此法不仅可显著降低患者临床体征，还可显著地改善糖尿病患者的糖脂代谢，防止并发症的发生和发展。刘彩玲用益气活血养阴法治疗糖尿病26例，结果显示治疗组空腹血糖、糖化血红蛋白（hbalc）均明显下降。吴吉萍等应用具有益气活血养阴功效的丹蛭降糖胶囊干预糖尿病合并大血管病变的患者，结果显示与对照组相比，丹蛭降糖胶囊可以有效改善治疗组患者的餐后血糖、hba1c和内皮素水平，提示具有益气活血养阴功效的中药胶囊能改善糖代谢并可以修复血管内皮功能。大量研究证明，具有益气活血养阴功效的参芪复方及其加减方，可以调节血脂生化指标，减轻高糖、高脂对血管的损伤，进而发挥保护血管作用。
3、中医药对疾病的诊治有着独特的见解。根据糖尿病“三多一少”的症状，中医将其归于“消渴”的范畴。而糖尿病血管并发症是现代病名，根据其临床表现，也可将其归于消渴的范围。其病因病机是因气阴两虚，燥热邪盛而至瘀血阻络。治当以益气养阴，活血化瘀。大量研究表明益气活血法可有效防治糖尿病血管病变，从改善糖代谢，减轻氧化应激和炎症反应等方面延缓糖尿病血管并发症的进程。
技术实现思路
1、本发明的技术目的，是为了解决背景技术中的问题，提供一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方及其应用。
2、本发明的技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
3、益气活血方由黄芪、生地黄、葛根、川芎、天花粉配成，所配益气活血方采用体外与体内实验，并采用模型样本的药理网络构建来验证表征；
4、益气活血方制备过程：称取适量黄芪、生地黄、葛根、川芎、天花粉于烧瓶中，加入水没过3cm后浸泡1h，浸泡后煎煮两次，过滤旋转蒸发浓缩至0.85-1.20g/ml后冻存备用；其中药材分量为黄芪20-30g，生地黄、葛根各5-15g，川芎、天花粉各3-8g。
5、所述益气活血方的效果验证步骤为：
6、（1）其他相关试剂制备：分别制备体内实验所需的二甲双胍溶液、 3%戊巴比妥、链脲佐菌素stz溶液和体外实验所需的3%戊巴比妥溶液、电泳缓冲液、转膜液、tbst溶液、封闭液、细胞裂解液、bca蛋白定量显色液与dmem培养基；
7、（2）体外与体内实验：
8、体内实验：选择spf级雄性sd大鼠，随机选择5-10只只作为正常组，其余大鼠采用尾静脉注射的方式一次性注射链脲佐菌素stz诱导t1dm大鼠模型；造模成功后随机将大鼠分为模型组、阳性药组（二甲双胍组）、益气活血组（益气活血方组），每组8只，给药4周；每周称量1次大鼠体重、1次空腹血糖 fbg；给药4周后对大鼠进行麻醉，采集血清，用elisa法检测各组大鼠icam-1和vcam-1水平；采集大鼠主动脉弓置于4%多聚甲醛中保存，并进行he染色观察其组织病理学变化；
9、体外实验：人脐静脉内皮细胞（huvec）复苏后，用含10%胎牛血清 fbs的高糖dmem培养基进行培养，并用葡萄糖浓度为50 mmol/l的dmem培养基进行造模；造模成功后用mtt法检测不同含量含药血清对细胞活力的影响从而选取最佳含药血清浓度；进行细胞划痕实验检测含药血清对高糖诱导的huvec的影响；运用网络药理学分析益气活血方对糖尿病血管损伤的作用靶点，并在体外运用western blot（wb）法验证其机制；
10、（3）数据处理与结果分析：对（2）的检测结果进行分析。
11、以生黄芪、川芎、葛根、生地、天花粉为组成。方中黄芪补脾益气，生津止渴，使脾气升散，散精达肺，运送输布津液为君药；生地黄清热凉血，养阴生津，滋养肾阴以降虚火，养阴津液以清伏热，是为臣药。川芎行气血，散瘀滞，为气滞血瘀之要药，为臣药。葛根生津止渴，引生地入阳明经治阳明中焦内热，同时助黄芪升发脾胃清阳，运散津液而止渴，是为臣药、引经药。佐以天花粉滋阴清热，润燥止渴。全方在益气养阴的基础上，加入活血通络之法，相辅相成，达到标本兼治。
12、作为优选，（1）中所述各溶液的配置方式为：
13、二甲双胍制备：按需要称取足量二甲双胍缓释片，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，使其终浓度为3 mg/ml，经过超声充分溶解后得到二甲双胍溶液；
14、链脲佐菌素的配制：将足量的stz粉末在避光条件下称取，使用0.1 mol/l柠檬酸缓冲液，ph为 4.5的柠檬酸缓冲液溶解stz，使其成浓度为2%的stz溶液；
15、3%戊巴比妥制备：称取所用分量的戊巴比妥固体，使用0.9%的氯化钠溶液充分溶解，得到3%的戊巴比妥溶液并4℃避光保存；
16、电泳缓冲液配置：将tris base、sds和glycine按3:1:14.4的比例精密称取，放入烧杯中并加入适量纯水，振荡液体使其充分溶解，继续加入纯水定容至1000 ml，放入4℃冰箱保存备用；
17、转膜液的制备：精密称取3.00 g tris base和14.50 g glycine，置于烧杯中，加入少许纯水，振荡混匀后加入200 ml乙醇，再定容至1000 ml，将配置好的转膜液转移至玻璃瓶中并置于4℃冰箱中保存备用；
18、tbst溶液的制备：称取2.42 g tris base、8.00 g nacl置于烧杯中，加入少许纯水，振荡液体使其充分混匀，继续加入纯水定容至1000 ml，用浓盐酸调节ph值至7.5以上；溶液转移至玻璃瓶之后加入1 ml的tween-20，待其充分混匀后置于4℃冰箱保存备用；
19、封闭液：为5%的tbst脱脂奶粉溶液；
20、细胞裂解液的制备：提前拿出enhanced ripa lysis buffer置于冰上使其充分溶解，按每2 ml enhanced ripa lysis buff加入30.4 μl pmsf的比例配置适量裂解液，使其终浓度为1mm；
21、bca蛋白定量显色液的制备：根据实验需要，将bca试剂a和bca试剂b按50:1的比例配置适量的bca工作液；
22、50 mmol/l dmem培养基的制备：将细胞用无水葡萄糖粉末加入pbs溶液定容至1ml，配置成浓度为3 mmol/l的葡萄糖溶液，使用微孔滤膜（0.22 μm）过滤葡萄糖溶液，然后将葡萄糖溶液加入50 ml高糖dmem培养基中，得到50 mmol/l的dmem培养基，置于4℃冰箱中保存。
23、作为优选，（2）中体内实验糖尿病大鼠模型建立选择若干sd大鼠，体重范围在260-280g之间，月龄6-8周，饲养期间自由饮食饮水；大鼠进行2周的适应性喂养之后禁食不禁水14 h，检测并记录此刻的空腹血糖和体重；使用链脲佐菌素（stz）造模，根据大鼠的体重按55 mg/kg给予一次性尾静脉注射stz，注射后继续禁食2 h；注射stz后，分别于第3天、7天、10天进行空腹血糖检测，选取血糖大于16.7 mmol/l的大鼠作为稳定模型，进入下一步实验；
24、（2）中体外实验所述高糖诱导huvec细胞损伤模型建立过程为：培养皿中huvec复苏、传代后冻存，用含10% fbs的高糖dmem培养基重悬细胞并稀释成密度为3×104个/ml的细胞悬液；在96孔板中每孔加入100 μl的细胞悬液，轻拍孔板使细胞均匀分布；将孔板置于细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁；确定贴壁后弃去培养基，加入不同葡萄糖浓度的培养基，放入培养箱中培养24-48 h。
25、作为优选，（2）中体内实验指标检测和he染色胸主动脉组织形态学观察；其中指标检测包括一般体征观察、体重记录、血糖检测和生态化指标检测；生化指标检测方法为各组大鼠在给药4周末处死，进行相关标本采集，大鼠处死前禁食不禁水12h，使用3%戊巴比妥进行腹腔注射麻醉大鼠，后进行腹主动脉采血，采集的血液静置30min后3000-5000rpm离心15min，吸取上清得到血清，使用elisa试剂盒检测大鼠血清中vcam-1和icam-1含量，并计算相应生化指标水平。
26、作为优选，he染色胸主动脉组织形态学观察过程为取大鼠心脏及主动脉弓部分剥离周围结缔组织固定在4%多聚甲醛中24h后脱水透明，处理好后切片按照苏木精中5 min，0.1%盐酸酒精10 s，纯水清洗2-5次，0.6%氨水返蓝2-5 s，流水冲洗，伊红染液3 min的顺序进行染色，染色后的切片再进行脱水处理封片后再光学显微镜下观察。
27、作为优选，（2）中体外实验mtt法为：培养结束后在避光条件下每孔加入50μl的mtt试剂（2 mg/ml），继续放入培养箱中孵育4 h；孵育结束后弃去孔内液体并在干净的卫生纸上轻轻拍打使孔内液体完全吸出；每孔加入150μl的dmso试剂，放在振荡器上振荡5-10min；待细胞结晶完全溶解后，放入酶标仪中，使用490 nm的波长测得吸光度值，计算各组细胞的相对存活率，公式为：细胞相对存活率=（od490高糖组-od490空白组）/（od490正常组-od490空白组）。
28、作为优选，（2）中细胞划痕实验过程为：用含10% fbs的高糖dmem培养基重悬细胞并稀释成密度为3×104个/ml的细胞悬液；在96孔板中每孔加入2ml的细胞悬液，轻拍孔板使细胞均匀分布；将孔板置于细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁；确定贴壁后弃去培养基，加入pbs清洗残余培养基，放入培养箱中培养24-48 h，后加入含2.5%空白大鼠血清和7.5%含药血清的高糖dmem培养基放入培养箱中干预48 h，结束后弃去孔内液体并用枪头划线加入pbs再洗掉多余的细胞；得到的产物在倒置显微镜下观察细胞划痕，分别在划后0 h、6 h、12 h、24 h用倒置显微镜观察细胞迁移情况并拍照，用image j测定0 h与24 h时的面积差。
29、作为优选，网络药理学分析过程为：益气活血方成分筛选后进行药物靶点预测与疾病靶点收集，获取药物与疾病的共同靶点后进行蛋白质互作ppi网络构建与富集分析，最后根据蛋白靶点与kegg信号通路之间的相互关系构建“中药-成分-靶点-通路-疾病”网络。
30、作为优选，western blot法检测蛋白水平过程为从干预结束的细胞中提取总蛋白后采用bca法测定蛋白浓度和配制蛋白样品，蛋白样品进行蛋白上样电泳与抗体孵育，最后进行成像显形后续数据分析处理；所有统计分析均使用spss 22.0软件和graphpadprism8.4.3软件进行。
31、采用本发明，优点在于结合上述益气活血方对高血糖产生的影响的验证方式，能够更深入直观的表现通过本发明的益气活血方配方对调控mapk信号通路改善糖尿病血管并发症的重大意义。
32、综上所述，本发明具有以下有益效果：
33、1、通过本发明的一种益气活血方调控mapk信号通路改善糖尿病血管并发症的方法，运用中医理论，根据消渴病阴虚火旺、燥热内生的病因病机，将经典方四物汤与玉液汤结合，自拟出益气活血方。方中以黄芪为君药，生地黄、川芎为臣药，天花粉为佐药，另用葛根为引经药，各味药材相辅相成，在益气养阴的基础上增添了活血化瘀的功效，以达到标本兼治的目的；
34、2、构建糖尿病动物模型和高糖损伤细胞模型，分别运用体内实验和体外实验来探究糖尿病对血管疾病的影响，运用网络药理学进行多组分-多靶点-多进程和多通路的优点，构建网络关系图整体性，展示益气活血方作用于糖尿病血管疾病的治疗靶点、生物学进程及其相关机制。
1.一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于，益气活血方由黄芪、生地黄、葛根、川芎、天花粉配成。
2.根据权利要求1所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于，益气活血方包括以下组分：
3.根据权利要求1所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
7.根据权利要求3所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方，其特征在于：
10.一种改善糖尿病血管并发症的益气活血方的应用，其特征在于：
