本发明涉及疫苗制备方法，尤其涉及一种多肽疫苗制备方法。
背景技术：
1、多肽疫苗指的是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗，多肽疫苗主要是用于预防病毒感染引起的疾病，比如流感病毒、疱疹病毒等，在一定程度上能够减少病毒感染，对身体有一定好处。
2、现传统的多肽疫苗在进行制备的过程中，无法高效多重去除杂质，导致多肽的纯度较低，影响疫苗的质量，也不能充分保证疫苗在储存和使用过程中的稳定性，容易导致疫苗失效，传统的制备步骤可能较为繁琐且耗时较长，导致生产效率低下，制备的灵活性有限，不能根据不同的病原体和抗原表位进行定制化大规模快速生产，进一步降低了多肽疫苗的制备效率。
3、因此，针对上述传统的多肽疫苗在进行制备的过程中，无法高效多重去除杂质，同时制备较为繁琐且耗时较长，不能根据不同的病原体和抗原表位进行定制化大规模快速生产的问题，可以设计一种可大规模生产，制备简便，可自适应多种多肽疫苗的多肽疫苗制备方法。
技术实现思路
1、为了克服传统的多肽疫苗无法高效多重去除杂质，同时制备较为繁琐且耗时较长，不能根据不同的病原体和抗原表位进行定制化大规模快速生产的问题。
2、本发明的技术方案为：一种多肽疫苗制备方法，以质量百分比计，包括如下组分：多肽抗原20～30％、载体10～50％、佐剂1～10％、稳定剂1～3％和防腐剂1～2％，其制备步骤如下；
3、步骤一：抗原表位
4、根据病原体抗原基因序列，利用生物信息学方法预测和选择有效的抗原表位作为多肽疫苗的候选序列，引入更先进neopredpipe和mupexi生物信息学工具和deep learning算法，结合机器学习技术，更精确地预测和筛选出具有高免疫原性和特异性的抗原表位，同时考虑病原体的变异性和逃逸机制，选择保守且有效的表位作为候选序列，从而确定疫苗的有效成分，为后续合成提供基础；
5、步骤二：表位验证
6、在抗原表位选择后，进行体外验证实验，通过合成候选表位多肽，检测其与特异性抗体或t细胞受体的结合能力，评估其免疫原性和特异性；
7、步骤三：合成多肽
8、启动多肽合成仪，采用固相肽合成技术，在树脂上逐步添加氨基酸，按照设计序列合成多肽，固相肽合成中的ph值在7.5-9之间，以确保氨基酸的氨基和羧基处于适当的解离状态，催化反应温度在60-80℃之间，溶剂可选择n,n-二甲基甲酰胺或二氯甲烷；
9、步骤四：多肽的载入
10、选择重组病毒颗粒、蛋白质或脂质体为适当的载体，载体占比为10～50％，使用载体表达系统将多肽抗原载入载体中，还可以选择纳米颗粒或病毒样颗粒vlp新型载体材料，同时考虑载体的靶向性和释放特性，以实现多肽抗原的精准递送和控释；
11、步骤五：效率评估
12、在载体载入多肽后，进行结合效率评估，通过elisa检测仪或western blot系统检测方法来测定载体上多肽的负载量和结合稳定性，在抗原表位验证实验中，候选表位多肽与特异性抗体或t细胞受体的结合能力应达到预定阈值，根据评估结果，调整载体与多肽的配比和结合条件，使载体与多肽的结合效率应达到90％以上；
13、步骤六：预处理
14、对上述合成的多肽进行采用物理沉淀进行粗提操作，以去除不需要的大分子和其他杂质；
15、步骤七：纯化加工
16、将已经过滤并脱气的流动相注入储液罐，用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中，启动泵，运行五分钟排除系统中的气泡，以固定速率运行流动相，直到基线平稳，设置样品运行参数，将溶液注入进样阀，启动注入命令，溶液随流动相进入色谱柱进行分离，通过软件监视各项读数，当检测器检测到溶液所有峰值后停止运行，通过逐渐改变流动相中有机溶剂的浓度，实现多肽与杂质的有效分离，还可以采用亲和色谱或离子交换色谱更为高效的色谱分离技术，结合质谱联用技术进行检测，实现多肽与杂质的高效分离和精准检测，上述为连续流生产技术，全自动机械化生产；
17、步骤八：超滤加工
18、从hplc色谱图上仔细收集目标多肽的纯化产物，确保没有杂质或污染物混入，使用超滤设备进一步去除溶液中的小分子杂质或调整多肽溶液的分子量分布；
19、步骤九：鉴定
20、利用质谱、核磁共振等技术使用质谱仪和nmr仪对纯化后的多肽进行结构鉴定和验证，确保其符合设计要求，进而确保多肽的结构正确性和生物活性；
21、步骤十：混合加工
22、将上述原料输送至混合器中，并且加入佐剂1～10％、稳定剂1～3％和防腐剂1～2％，以提高疫苗的免疫原性和稳定性；
23、步骤十一：制剂制备
24、将配伍好的多肽疫苗制成适合注射的制剂形式，若需要制备成液体疫苗，可以采用灌装机进行灌装包装，若需要制备成冻干粉疫苗，则使用冻干机进行制备处理，还可以制备成微针贴片或口服胶囊的形式，以适应不同接种途径和患者需求；
25、步骤十二：质量控制
26、使用微生物限度检测仪、稳定性试验箱、紫外分光光度计等对制备好的多肽疫苗进行一系列的质量控制检测，确保疫苗的质量符合相关标准和规定，保证疫苗的安全性和有效性。
27、优选的，该多肽疫苗制备过程中加入了稳定剂和防腐剂，有助于保持疫苗在储存和使用过程中的稳定性和安全性，通过物理沉淀、hplc纯化、超滤加工等步骤，能够高效去除杂质，提高多肽的纯度，确保疫苗的质量，同时选择合适的载体，并使用载体表达系统将多肽抗原载入载体中，提高了多肽的免疫原性和稳定性，整个多肽疫苗的制备主要依赖于化学合成，这使得生产过程相对简单且易于规模化，能够满足大规模生产的需求，也使得多肽的合成过程更加自动化和高效，还可根据不同的病原体和抗原表位进行定制化生产，适用于多种疾病的预防和治疗，大大提升了多肽疫苗的制备速度。
28、作为优选，佐剂可以采用干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、胞嘧啶-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸、双链rna、单磷酸脂质a、包含铝盐和mpl、cpgodn和tlr配体的复合佐剂的其中一种或多种。
29、作为优选，稳定剂可以采用吐温系列、泊洛沙姆、抗坏血酸、谷胱甘肽和乙二胺四乙酸的其中一种或多种制备液体疫苗。
30、作为优选，防腐剂可以采用硫柳汞、苯酚和2-苯氧乙醇的其中一种。
31、作为优选，稳定剂可以采用蔗糖、海藻糖、甘氨酸、精氨酸、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液的其中一种或多种制备冻干粉疫苗。
32、作为优选，步骤四中若多肽溶液中含有盐类、低分子量有机物等小分子杂质，可以使用透析装置进行初步纯化。
33、作为优选，步骤八中混合器可以采用漩涡混合器或者磁力搅拌器，还可以采用离心机去除产生的沉淀物。
34、作为优选，离心机的转速范围在5000-2000rpm之间，离心时间在8-15分钟之间。
35、本发明的有益效果：
36、1、该多肽疫苗制备过程中加入了稳定剂和防腐剂，有助于保持疫苗在储存和使用过程中的稳定性和安全性，通过物理沉淀、hplc纯化、超滤加工等步骤，能够高效去除杂质，提高多肽的纯度，确保疫苗的质量，同时选择合适的载体，并使用载体表达系统将多肽抗原载入载体中，提高了多肽的免疫原性和稳定性，佐剂可以采用cpg odn和tlr配体等具有免疫调节功能的佐剂，以增强疫苗的免疫原性和稳定性，而使用纳米颗粒或病毒样颗粒vlp的新型载体材料，其具有更好的生物相容性和免疫刺激能力，以实现多肽抗原的精准递送和控释，整个多肽疫苗的制备主要依赖于化学合成，这使得生产过程相对简单且易于规模化，能够满足大规模生产的需求，也使得多肽的合成过程更加自动化和高效，还可根据不同的病原体和抗原表位进行定制化生产，适用于多种疾病的预防和治疗，大大提升了多肽疫苗的制备速度，相较于现传统的多肽疫苗在进行制备的过程中，无法高效多重去除杂质，同时制备较为繁琐且耗时较长，不能根据不同的病原体和抗原表位进行定制化大规模快速生产而言，该多肽疫苗能够大规模快速批量化生产。
1.一种多肽疫苗制备方法，其特征在于，以质量百分比计，包括如下组分：多肽抗原20～30％、载体10～50％、佐剂1～10％、稳定剂1～3％和防腐剂1～2％，其制备步骤如下；
2.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：佐剂可以采用干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、胞嘧啶-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸、双链rna、单磷酸脂质a、包含铝盐和mpl、cpg odn和tlr配体的复合佐剂的其中一种或多种。
3.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：稳定剂可以采用吐温系列、泊洛沙姆、抗坏血酸、谷胱甘肽和乙二胺四乙酸的其中一种或多种制备液体疫苗。
4.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：防腐剂可以采用硫柳汞、苯酚和2-苯氧乙醇的其中一种。
5.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：稳定剂可以采用蔗糖、海藻糖、甘氨酸、精氨酸、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液的其中一种或多种制备冻干粉疫苗。
6.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：步骤四中若多肽溶液中含有盐类、低分子量有机物等小分子杂质，可以使用透析装置进行初步纯化。
7.根据权利要求1所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：步骤八中混合器可以采用漩涡混合器或者磁力搅拌器，还可以采用离心机去除产生的沉淀物。
8.根据权利要求6所述的多肽疫苗制备方法，其特征在于：离心机的转速范围在5000-2000rpm之间，离心时间在8-15分钟之间。
