本发明属于纳米酶探针，具体涉及一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器及其制备方法和在可视化检测亚硝酸盐中的应用。
背景技术：
1、亚硝酸盐在食品加工中用作食品添加剂，具有有益和不利的双面影响。研究发现结直肠癌/胃癌的发病率与加工食品的膳食摄入之间存在一定的相关性，因此深入探索了此类添加剂的作用。虽然亚硝酸盐与此类癌症没有直接关系，但它可以与酰胺反应形成致癌的n-亚硝胺。过量摄入亚硝酸盐会引起胃肠道反应和全身缺氧等症状。由于这些原因，有必要准确测定亚硝酸盐以确保食品安全。
2、亚硝酸盐检测的方法已经开发，包括色谱、电化学和光谱传感等技术。在所有这些方法中，荧光法和比色法通常用作检测亚硝酸盐的光学双信号输出。然而大多数光学双信号传感策略依赖于单波长，并受到环境因素和仪器效率等限制。因此，亟需开发一种快速、高效、定量检测亚硝酸盐的新方法。
3、为了弥补上述的不足，双波长的比率式传感策略备受青睐。因为该策略可以有效地消除不利干扰，又可提高分析数据的可靠性，这归因于其固有的自校准。目前，基于具有类酶活性和荧光的纳米酶的双信号传感器已被广泛研究。然而这些传感器的光学信号通常以单波长的形式输出。因此，探索用于亚硝酸盐检测的双波长-双信号传感器具有挑战性。
4、碳点作为一种新兴的碳纳米材料，由于易于合成、低毒、高溶解度、优异的光学性能和可调的催化活性，不仅被广泛用作荧光探针，还被广泛用作比色纳米酶。
技术实现思路
1、为了解决目前基于碳点纳米酶的双信号传感器依赖于单波长，容易限制于环境因素和仪器效率的问题，本发明提供了一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器及其制备方法和在可视化检测亚硝酸盐中的应用。
2、本发明由如下技术方案实现：一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，以茶多酚为碳前驱体，乙二胺为氮掺杂剂，通过一步水热合成法得到氮掺杂碳点n-cds纳米酶，然后透析、过滤，冷冻干燥得到免金属碳点纳米酶n-cds粉末；利用n-cds纳米酶的光致发光和类酶活性双重特性与亚硝酸盐介导的底物邻苯二胺（opd）或3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（tmb）的重氮化，构建亚硝酸盐介导的比率式n-cds/opd荧光传感器或n-cds/tmb比率比色传感器。
3、所述氮掺杂碳点n-cds纳米酶的制备方法包括：
4、（1）称取0.1 g茶多酚和1.5 mmol 乙二胺，溶解于10 ml超纯水，在15 khz，25℃下，超声处理5分钟；将所得澄清溶液转移至含有聚四氟乙烯内衬的高压釜中，以10℃/min的升温速率升温至200℃，保温8 h；待反应完毕，温度自然冷却至室温，得到深褐色溶液；
5、（2）将所得深褐色溶液转移至截留分子量为1000 da的透析袋，并置于水中，透析24 h，每6h换一次水，经透析后的液体通过0.22 μm的滤膜，滤液-60℃冷冻干燥36 h，收集棕色粉末，即为n-cds纳米酶。
6、所述比率式n-cds/opd荧光传感器的制备方法包括：
7、（1）储备液的制备：n-cds粉末溶解于超纯水中，得浓度为10 mg/ml的n-cds储备液；opd粉末溶解于超纯水中，得浓度为50 mmol/l的opd储备液；亚硝酸钠粉末溶解于超纯水中，得浓度为10 mmol/l、1 mmol/l的亚硝酸盐储备液；
8、（2）构建比率式n-cds/opd荧光探针：将0.5-10 μl 1 mmol/l的亚硝酸储备液或1-55 μl 10 mmol/l亚硝酸盐储备液，和20 μl opd储备液依次引入0.1 mol/l hcl溶液中，反应后生成苯并三氮唑bta，反应5min后，用2 mol/l naoh将反应液的ph调节至7.0-9.0，激活bta的黄色荧光；随后将2 μl蓝色发光n-cds储备液与上述溶液充分混合，用超纯水稀释至1.0 ml，即为比率式n-cds/opd荧光传感器。
9、进一步的，所述n-cds与opd的浓度比为20 μg/ml：1 mmol/l；所述比率式n-cds/opd荧光传感器的终体积为 1.0 ml。
10、所述n-cds/tmb比率比色传感器的制备方法包括：
11、（1）储备液的制备： n-cds粉末溶解于超纯水中，得浓度为10mg/ml的n-cds储备液；tmb粉末溶解于超纯水中，得浓度为10mmol/l的tmb储备液；亚硝酸钠粉末溶解于超纯水中，得浓度为10 mmol/l、1mmol/l的亚硝酸盐储备液；
12、（2）构建n-cds/tmb比率比色传感器：10 μl tmb储备液和10 μl n-cds储备液依次加入到500 μl hac-naac 缓冲溶液中；在365 nm、20 μw/cm2的紫外线下照射15min，tmb被催化为氧化的tmb即tmbox；随后，将0.5-10 μl 1 mmol/l的亚硝酸储备液或1-17.5 μl 10mmol/l亚硝酸盐储备液，按照梯度加入上述反应液中孵育15min，用超纯水稀释至1.0 ml，即为n-cds/tmb比率比色传感器。
13、进一步的，所述hac-naac 缓冲溶液的浓度为0.2 m，ph为3.5。
14、所述n-cds与tmb的浓度比为100 μg/ml：100 μmol/l；所述比率比色传感器的终体积为1.0 ml。
15、所述免金属碳点纳米酶比率双信号传感器在可视化检测亚硝酸盐中的应用，具体应用方法为：
16、（1）搭建智能手机辅助传感平台：将n-cds/opd荧光传感器溶液或n-cds/tmb比率比色传感器溶液与不同浓度的亚硝酸盐在试管中孵育；随后，将试管置于顶部设有紫外灯或日光灯的暗箱内，打开紫外灯或日光灯，智能手机在暗箱正面的监控窗口中进行拍摄；
17、（2）颜色信息的获取：通过智能手机识别获得的图像颜色并将其转换为r，g和b值；
18、（3）标准曲线的建立：通过数据处理，建立r/b或r/g比值与亚硝酸盐浓度的标准曲线；通过origin软件线性拟合，比率式n-cds/opd荧光传感器的r/b比值与亚硝酸盐浓度间的线性方程为：r/b = 0.0048c（亚硝酸盐）+ 0.3544, r2= 0.993，线性范围为：2~150 μmol/l，最低检出限为1.92 μmol/l；比率式n-cds/tmb比色传感器的r/g比值与亚硝酸盐浓度间的线性方程为：r/g = 0.0048c（亚硝酸盐）+ 0.5836 (r2= 0.995)，线性范围为：5~100 μmol/l，最低检出限为1.36 μmol/l；
19、（4）实际样品中亚硝酸盐的测定：将实际样品溶液替换亚硝酸盐标准溶液，按照所述步骤进行反应，并获取实际样品的颜色信息，使用智能手机计算器将r/b或r/g值代入线性方程，计算实际样品中的亚硝酸盐含量。
20、步骤（1）中所述紫外灯为365 nm。
21、进一步的，步骤（4）中所述实际样品在检测前进行前处理，具体处理方法为：将实际样品与50 g/l的四硼酸钠溶液混合，用搅拌机研磨成浆，浸入超纯水中，在70℃下加热15min；然后106 g/l亚铁氰化钾溶液和220 g/l醋酸锌溶液加入到上述溶液，搅拌使蛋白质沉淀，并用超纯水稀释，得到均匀的溶液。
22、步骤（4）中所述实际样品为腌制猪肉、咸鱼或牛肉干。
23、本发明选择无金属碳点纳米酶作为双信号-双波长传感器的候选者来检测亚硝酸盐。最重要的是，与单波长传感器相比，双波长传感器的明显颜色变化更容易被肉眼识别，这为构建更灵敏的智能手机辅助传感平台奠定了基础。结合智能手机设备、光学双信号输出和比率传感策略，不仅可以实现目标物的现场实时检测，还可以极大地提高测量数据的准确度。
24、与现有技术相比，本发明将智能手机、光学双信号输出和比率传感策略集中在同一碳点纳米酶体系中。亚硝酸盐暴露于 n-cds/opd 系统会产生重氮化合物苯并三氮唑（bta），从而在 n-cd 和 bta 之间产生内滤效应，并呈现比率荧光响应，因此，其比率荧光信号可进一步用于手机辅助的可视化荧光检测；同样，n-cds/tmb体系在n-cds的催化作用下首先生成氧化的tmb（tmbox），然后在引入亚硝酸盐后转化为重氮化的tmbox，并呈现比率比色响应，因此，其比率比色信号可进一步用于手机辅助的可视化比色检测。总而言之，与其他检测亚硝酸盐的方法相比，该方法具有现场可视化、灵敏度高、选择性好等优点，为亚硝酸盐检测提供了一种全新的方法。
1.一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：以茶多酚为碳前驱体，乙二胺为氮掺杂剂，通过一步水热合成法得到氮掺杂碳点n-cds纳米酶，然后透析、过滤，冷冻干燥得到免金属碳点纳米酶n-cds粉末；利用n-cds纳米酶的光致发光和类酶活性双重特性与亚硝酸盐介导的底物邻苯二胺opd或3,3′，5,5′-四甲基联苯胺tmb的重氮化，构建亚硝酸盐介导的比率式n-cds/opd荧光传感器或n-cds/tmb比率比色传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：氮掺杂碳点n-cds纳米酶的制备方法包括：
3.根据权利要求1所述的一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：所述比率式n-cds/opd荧光传感器的制备方法包括：
4.根据权利要求3所述的一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：所述n-cds与opd的浓度比为20 μg/ml：1 mmol/l；所述比率式n-cds/opd荧光传感器的终体积为 1.0 ml。
5.根据权利要求1所述的一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：所述n-cds/tmb比率比色传感器的制备方法包括：
6.根据权利要求5所述的一种基于免金属碳点纳米酶比率双信号传感器，其特征在于：所述hac-naac 缓冲溶液的浓度为0.2 m，ph为3.5；所述n-cds与tmb的浓度比为100 μg/ml：100 μmol/l；所述比率比色传感器的终体积为1.0 ml。
7.权利要求1所述免金属碳点纳米酶比率双信号传感器在可视化检测亚硝酸盐中的应用，其特征在于：具体应用方法为：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述紫外灯为365 nm。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤（4）中所述实际样品在检测前进行前处理，具体处理方法为：将实际样品与50 g/l的四硼酸钠溶液混合，用搅拌机研磨成浆，浸入超纯水中，在70℃下加热15 min；然后106 g/l亚铁氰化钾溶液和220 g/l醋酸锌溶液加入到上述溶液，搅拌使蛋白质沉淀，并用超纯水稀释，得到均匀的溶液。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤（4）中所述实际样品为腌制猪肉、咸鱼或牛肉干。
