本发明属于医学诊断领域，涉及通过测定血清中的线粒体双链rna(mitochondrial double stranded rna,mt-dsrna)来制备用于评估狼疮性肾炎的活动性与预后的试剂盒的应用。
背景技术：
1、狼疮性肾炎(lupus nephritis,ln)是自身免疫疾病系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus,sle)的肾脏损害，是sle最常见和最重要的内脏并发症[1]。ln是我国最常见的继发性肾小球疾病，也是导致患者死亡的主要原因[2]。尽管ln患者的护理总体上有所改善，5年和10年肾脏存活率有所提高，但其预后仍然令人不满意[3]。ln的肾脏活动状态评估与持续监测对ln患者的预后具有重要意义。
2、尽管肾活检仍然是ln诊断、肾脏活动状态评估与预后评估的金标准，但其侵入性和潜在的并发症使其不适合进行持续监测[4]。然而，现有的常规实验室标记物在评估ln的肾脏活动状态与预后时存在一些问题[5]。有研究表明，24h蛋白尿、肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,egfr)是评估ln患者的主要生物标志物，与ln患者的肾脏预后显著相关[3]。然而，当涉及ln的肾脏活动状态评估时，这两者的相关性却并不显著，因此不能被认为是ln肾脏活动状态的最可靠标志物[6]。此外，血清抗双链dna抗体水平的上升往往预示着ln的发作[7]。当抗体水平出现显著升高时，对患者实施预防性治疗措施可能有助于降低ln的发病率。然而，血清抗双链dna抗体水平与肾脏活动状态的相关性并不显著[8]。因此，寻找一种有助于判定ln患者的肾脏活动状态及预后的生物标志物非常重要。理想的ln生物标志物应具备如下特点：(1)能够评估肾脏活动状态；(2)能够定义ln的复发及缓解，以监测对ln干预的临床效果；(3)检测标本容易获得，无创，易于在床边或临床标准实验室进行，快速、方便、测定费用低廉。目前尚无任何单一的生物标志物符合这些标准，需要多种生物标志物联合使用[8]。随着功能性基因组学和蛋白质组学的发展，研究人员从血清样本中筛选出了一些有临床应用前景的ln新型生物标志物，例如血清vcam-1[9]、血清icam-1[9]、血清mcp-1[10]。尽管相较于健康对照者，这些标志物的表达水平在ln患者的血清中升高，然而，这些标志物的表达水平与ln肾脏活动性或肾脏病理的相关性不足。此外，这些生物标志物还需要进一步在实践中评价和验证它们的敏感性和特异性、肾脏损害之后它们出现的时限、对长期和短期预后的作用等。开展新型分子标志物研究对ln进行疗效监测及预后评估有重要意义。同时也为发病机制的研究和治疗靶点的探寻提供新的线索，更有助于靶向个体化精准医疗的实现。
3、线粒体是内共生细菌的产物，是一种保留了基本原核特征的细胞器[11],是活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtros)产生的重要场所[12]，由活性氧诱导的氧化应激会导致肾组织发生脂质过氧化(lipid peroxidation,lpo)，最终导致肾脏细胞的铁死亡。此外，鉴于线粒体的微生物起源，这种细胞器长期以来一直是ln自身抗原的一个有吸引力的来源[13]。抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody,ama)在ln中已有描述，它们针对的抗原包括线粒体外膜(mitochondrial outer membrane,mom)、线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)、线粒体rna(mitochondrial rna,mtrna)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,hsp60)等。这些抗线粒体抗体能够和对应的抗原结合形成免疫复合物，沉积在肾小球系膜或内皮下和上皮下间隙中，进而导致肾小球内出现由免疫复合物介导的新月体[13]。此外，这些免疫复合物还会导致巨噬细胞的趋化与极化，进而导致肾脏间质炎细胞浸润[14]。不仅如此。这些免疫复合物可以通过经典途径，经过一系列级联反应后激活补体，诱导产生膜攻击复合物，最终导致肾脏组织损伤[15]。这些研究提示靶向线粒体是保护线粒体结构和功能并改善肾脏损伤的潜在干预措施。
4、在哺乳动物中，线粒体dna受到双向转录，产生重叠转录物，形成线粒体双链rna(mitochondrial double stranded rna,mt-dsrna)[16]。作为先天免疫应答的一部分，mt-dsrna是内源性dsrna最主要的来源[17]。目前报道有三种类型的dsrna模式识别受体，包括维甲酸诱导基因i(retinoic acid inducible gene-i,rig-1)、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation related gene 5,mda5)[18]和toll样受体3(toll-likereceptor 3,tlr3)[19]。这些mt-dsrna会由相关的降解复合物，例如多核苷酸磷酸化酶(polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1,pnpt1)和线粒体rna解旋酶(supv3l1,suv3)形成的复合物所降解，以避免免疫应答的激活[20]。pnpt1和suv3在线粒体内形成rna降解复合物，与dsrna和dsdna共定位[21]。pnpt1与suv3对mt-dsrna的降解至关重要，pnpt1与suv3缺失会导致mt-dsrna半衰期增加以及mt-dsrna降解中间体的积累。在细胞中沉默suv3的表达，会提高成熟mrna的稳定性，并使正常条件下因低丰度或被快速去除而难以观察到的rna蓄积，包括mt-dsrna衰变中间体、异常形成的rna、rna加工副产物以及大量非编码反义rna[22]。
5、因此，不难推测mt-dsrnas一旦从线粒体中泄漏出来，即具有较强的免疫原性，促进疾病的发生和发展。除此之外，不同的mt-dsrnas还具有不同的功能，例如：cox3缺陷存在于伴有乳酸酸中毒和中风样发作(melas)综合征以及复发性肌红蛋白尿的线粒体脑肌病中；cox2在生理条件下的一些组织中组成性表达，如内皮、肾脏和大脑，在病理条件下上调，如在癌症和炎症中，它的上调与细胞粘附增加、表型变化、抗凋亡和肿瘤血管生成有关。nd4l与leber遗传性视神经病变和糖尿病有关；。cytb则参与包括电子输运耦合质子输运以及对胰高血糖素的反应，并与卵巢癌和膀胱癌症有关；atp6对各种细胞成分的酸化至关重要，包括内体、溶酶体、网格蛋白包被的囊泡、分泌囊泡和嗜铬颗粒；atp8可能参与多发性硬化症的发病机制；nd1可能参与泛醌的电子转移，其突变可能与多种疾病有关，包括leber遗传性视神经病变、阿尔茨海默病和帕金森病。
6、综上所述，作为致病分子之一，mt-dsrna在疾病活动状态与预后评估等领域具有显著的应用潜力。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供与ln的肾脏活动状态及预后评估相关的血清mt-dsrna生物标志物。
2、本发明的另一目的是提供所述标志物的应用。
3、本发明的技术方案通过以下方法获得：
4、1)运用真核转录组重测序技术及独立样本rt-qpcr技术，分析健康对照血清样本与ln患者血清样本中mt-dsrna的表达水平，探索mt-dsrna作为ln血清生物标志物的潜力。
5、2)运用rt-qpcr技术，对健康对照者(health control,hc)、非活动性ln患者(inactiveln,iln)以及活动性ln患者(active ln,aln)的血清mt-dsrna表达水平进行检测，筛选出在区分iln与aln方面拥有巨大潜力的mt-dsrna。
6、3)运用rt-qpcr技术，在更大的ln样本集中，对iln患者以及aln患者血清mt-dsrna进行检测，进一步筛选出区分iln与aln方面拥有巨大潜力的mt-dsrna。
7、4)通过mann-whitney u检验以及lasso回归，对低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者的mt-dsrna表达水平进行差异表达分析，筛选出在区分不同病理活动程度的ln患者方面表现优异的mt-dsrna。
8、5)通过mann-whitney u检验以及lasso回归，对不同预后情况的ln患者血清mt-dsrna表达水平进行差异表达分析，筛选出在区分不同预后情况的ln患者方面表现优异的mt-dsrna。
9、本发明的目的可通过以下技术方案实现：
10、检测线粒体双链rna的试剂在制备狼疮性肾炎血清辅助诊断试剂和/或预后辅助诊断试剂中的应用，所述的线粒体双链rna选自nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中的任意一种或多种。
11、作为本发明的一种优选，所述的检测线粒体双链rna的试剂为pcr扩增线粒体双链rna的特异性引物；pcr扩增nd1的特异性引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示，pcr扩增nd4的特异性引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示，pcr扩增nd4l的特异性引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示，pcr扩增cox2的特异性引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，pcr扩增atp6的特异性引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示，pcr扩增atp8的特异性引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示。
12、作为本发明的进一步优选，检测线粒体双链rna nd4l和cox2的试剂在制备具备以下任意一种功能的血清辅助诊断试剂中的应用：
13、1)区分健康人与非活动性ln患者；
14、2)区分健康人与活动性ln患者；
15、3)区分非活动性ln患者和活动性ln患者。
16、作为本发明的进一步优选，检测线粒体双链rna nd1、nd4l与atp8的试剂在制备区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者的血清辅助诊断试剂中的应用；优选检测线粒体双链rna nd1、nd4l与atp8的试剂联合检测血肌酐、血清白蛋白、24h尿蛋白的试剂在制备区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者的血清辅助诊断试剂中的应用。
17、作为本发明的进一步优选，检测线粒体双链rna nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中至少三种线粒体双链rna的试剂联合或者不联合检测血清中血肌酐、血清白蛋白、24h尿蛋白中至少两项指标的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用。
18、作为本发明的进一步优选，检测线粒体双链rna nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8的试剂在制备以下任意功能的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用：
19、1)区分完全缓解ln患者与部分缓解ln患者；
20、2)区分完全缓解ln患者与复发ln患者；
21、3)区分部分缓解ln患者与复发ln患者。
22、在本发明的一种具体实施方式中，检测线粒体双链rnand1、nd4和cox2的试剂联合检测血肌酐和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分完全缓解ln患者与部分缓解ln患者。
23、在本发明的一种具体实施方式中，检测线粒体双链rnand1、nd4和nd4l的试剂联合检测血肌酐和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分完全缓解ln患者与复发ln患者。
24、在本发明的一种具体实施方式中，检测线粒体双链rna atp6、atp8和nd4的试剂联合检测血肌酐、血清白蛋白和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分区分部分缓解ln患者与复发ln患者。
25、一种狼疮性肾炎血清辅助诊断试剂和/或预后辅助诊断试剂，含有检测所述的线粒体双链rna的试剂；优选含有检测nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中的任意一种或多种的pcr特异性引物；进一步优选包含所述的引物。
26、有益效果：
27、本专利通过选取不同活动性及预后的ln患者，提供mt-dsrna在检测和诊断ln患者活动性与预后中的应用，获得了作为ln血清生物标志物的mt-dsrna。本发明提供的作为ln血清生物标志物的mt-dsrna具备以下功能：
28、1)区分iln与aln
29、人类血清真核转录组重测序以及独立样本rt-qpcr的结果显示，相对于健康对照者，ln患者血清中大部分编码功能的mt-dsrna相对表达水平显著升高，包括cox2、nd4、cox3、nd4l、atp8、cox1、atp6、nd2、nd3和nd6。由小批量的hc与ln样本组成的训练集结果显示6个mt-dsrna(nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8)在区分hc、iln与aln时表现优异。由大批量ln样本组成的验证集结果显示2个mt-dsrna(cox2和nd4)在区分iln与aln时表现优异，mt-dsrna联合区分iln与aln时，曲线下面积为0.905。
30、区分低病理活动性与高病理活动性ln
31、我们发现nd1、nd4l、atp8在区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者时表现优异。生化信息与mt-dsrna联合使用效果更好，联合使用区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者时，曲线下面积可达0.95。
32、区分不同预后情况的ln
33、预后研究结果显示6个基因(nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8)在区分不同预后的狼疮患者方面表现优异。生化信息与mt-dsrna联合使用区分完全缓解与部分缓解ln患者时，曲线下面积为0.938；区分完全缓解与复发ln患者时，曲线下面积为0.988；区分部分缓解与复发ln患者时，曲线下面积为0.979。
34、总结：
35、本发明的mt-dsrna组合能够评估ln患者的肾脏活动状态或预后，且与生化指标联合使用，可以提高单一指标的灵敏度和特异性。此外，mt-dsrna能够定义ln的复发及缓解，且与生化指标联合使用，可以提高单一指标的灵敏度和特异性。因此通过将mt-dsrna与现有的生化指标联合，我们能够更加精准、高效地评估ln的发生发展进程，进而据此制定出适合不同ln患者的个性化治疗方案。
1.检测线粒体双链rna的试剂在制备狼疮性肾炎血清辅助诊断试剂和/或预后辅助诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的线粒体双链rna选自nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的检测线粒体双链rna的试剂为pcr扩增线粒体双链rna的特异性引物；pcr扩增nd1的特异性引物序列如seq id no.1和seq idno.2所示，pcr扩增nd4的特异性引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示，pcr扩增nd4l的特异性引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示，pcr扩增cox2的特异性引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，pcr扩增atp6的特异性引物序列如seq id no.9和seq idno.10所示，pcr扩增atp8的特异性引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rna nd4l和cox2的试剂在制备具备以下任意一种功能的血清辅助诊断试剂中的应用：
4.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rna nd1、nd4l与atp8的试剂在制备区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者的血清辅助诊断试剂中的应用；优选检测线粒体双链rna nd1、nd4l与atp8的试剂联合检测血肌酐、血清白蛋白、24h尿蛋白的试剂在制备区分低病理活动性ln患者与高病理活动性ln患者的血清辅助诊断试剂中的应用。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rna nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中至少三种线粒体双链rna的试剂联合或者不联合检测血清中血肌酐、血清白蛋白、24h尿蛋白中至少两项指标的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rna nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8的试剂在制备以下任意功能的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rnand1、nd4和cox2的试剂联合检测血肌酐和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分完全缓解ln患者与部分缓解ln患者。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rnand1、nd4和nd4l的试剂联合检测血肌酐和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分完全缓解ln患者与复发ln患者。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于检测线粒体双链rna atp6、atp8和nd4的试剂联合检测血肌酐、血清白蛋白和24h尿蛋白的试剂在制备区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂中的应用，所述的区分狼疮性肾炎预后情况的血清辅助诊断试剂用于区分区分部分缓解ln患者与复发ln患者。
10.一种狼疮性肾炎血清辅助诊断试剂和/或预后辅助诊断试剂，其特征在于含有检测权利要求1中所述的线粒体双链rna的试剂；优选含有检测nd1、nd4、nd4l、cox2、atp6和atp8中的任意一种或多种的pcr特异性引物；进一步优选包含权利要求2中所述的引物。
