本发明总体涉及包括作为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物的至少第一可切割部分(cm1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物的至少第二可切割部分(cm2)的多肽，包括这些至少包括作为至少一种mm蛋白酶的底物的cm1和作为至少一种sp蛋白酶的底物的cm2的多肽的可活化抗体和其它更大分子，并涉及各种治疗、诊断和预防适应症中制备和使用这些至少包括作为至少一种mm蛋白酶的底物的cm1和作为至少一种sp蛋白酶的底物的cm2的多肽的方法。
背景技术：
1、蛋白酶是通过切割氨基酸残基之间的肽键来降解蛋白的酶。蛋白酶天然存在于所有生物体中，并且涉及从简单降解至高度调节的途径的各种生理反应。已知一些蛋白酶基于蛋白内特定氨基酸序列的存在而破坏特定的肽键。
2、因此，需要鉴定蛋白酶的新底物并且在各种治疗、诊断和预防适应症中使用这些底物。
技术实现思路
1、本发明提供了包括作为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物的至少第一可切割部分(cm1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物的至少第二可切割部分(cm2)的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中统称为“cm1-cm2底物”。该术语不旨在传达关于作为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物的第一可切割部分(cm1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物的至少第二可切割部分(cm2)的取向或其它结构排列的任何要求。因此，术语“cm1-cm2底物”涵盖具有如下的n-端至c-端的结构排列的cm1-cm2底物：cm1-cm2或cm2-cm1。术语“cm1-cm2底物”还涵盖其中cm1序列的至少一部分与cm2序列的至少一部分重叠的底物。
2、本文所述的cm1-cm2底物可用于各种治疗、诊断和预防性适应症中。例如，这些cm1-cm2底物可用于可活化抗体，其包括抗体或其抗原结合片段(ab)，其包括与ab的至少一个抗原或表位结合结构域连接的至少一个掩蔽部分(mm)，使得mm的偶联降低ab结合其靶标的能力。
3、在一些实施方案中，可活化抗体至少包括第一cm(cm1)和第二cm(cm2)。在一些实施方案中，cm1底物序列的至少部分与cm2序列的至少部分重叠。在一些实施方案中，cm1底物序列和cm2底物序列共有至少一个共同氨基酸残基。在一些实施方案中，cm1底物序列和cm2底物序列共有至少两个共同氨基酸残基。在一些实施方案中，cm1底物序列和cm2底物序列共有至少三个共同氨基酸残基。在一些实施方案中，cm1底物序列和cm2底物序列共有三个或更多个共同氨基酸残基。
4、在一些实施方案中，cm1和cm2是可操作连接在一起的分开的多肽。
5、在一些实施方案中，cm1和cm2是直接连接在一起的分开的多肽，即，一个底物的n-端与另一底物多肽的c-端直接连接。在一些实施方案中，cm1的n-端与cm2的c-端直接连接。在一些实施方案中，cm2的n-端与cm1的c-端直接连接。
6、在一些实施方案中，cm1和cm2是经由至少一个连接部分可操作连接在一起的分开的多肽。
7、在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体中的第一可切割部分cm1和第二可切割部分cm2具有如下的从n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2-ab、ab-cm2-cm1-mm、mm-cm2-cm1-ab或ab-cm1-cm2-mm。
8、在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括掩蔽部分(mm)和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。
9、在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm2和掩蔽部分(mm)之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。
10、在一些实施方案中，lp'是gg。在一些实施方案中，lp'是ggsggs(seq id no:350)。
11、在一些实施方案中，cm1是至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物。mmp的实例包括mmp1；mmp2；mmp3；mmp7；mmp8；mmp9；mmp10；mmp11；mmp12；mmp13；mmp14；mmp15；mmp16；mmp17；mmp19；mmp20；mmp23；mmp24；mmp26；和mmp27。
12、在一些实施方案中，cm1是mmp2、mmp9、mmp14、mmp1、mmp3、mmp13、mmp17、mmp11和/或mmp19的底物。在一些实施方案中，cm1是mmp2的底物。在一些实施方案中，cm1是mmp9的底物。在一些实施方案中，cm1是mmp14的底物。在一些实施方案中，cm1是两种或更多种mmp的底物。在一些实施方案中，cm1是至少mmp9和mmp14的底物。在一些实施方案中，cm1是至少mmp2和mmp9的底物。在一些实施方案中，cm1是至少mmp2和mmp14的底物。在一些实施方案中，cm1是三种或更多种mmp的底物。在一些实施方案中，cm1是至少mmp2、mmp9和mmp14的底物。在一些实施方案中，cm1包含相同的mmp的两种或更多种底物。在一些实施方案中，cm1包含至少两种或更多种mmp2底物。在一些实施方案中，cm1包含至少两种或更多种mmp9底物。在一些实施方案中，cm1包含至少两种或更多种mmp14底物。
13、在一些实施方案中，cm1是mmp的底物且至少包括序列issgllss(seq id no:20)；qnqalrma(seq id no:21)；aqnllgmv(seq id no:351)；stfpfgmf(seq id no:352)；pvgytssl(seq id no:353)；dwlywpgi(seq id no:354)；miapvayr(seq id no:355)；rpspmway(seq id no:356)；watprpmr(seq id no:357)；frlldwqw(seq id no:358)；lkaaprwa(seq id no:359)；gpshlvlt(seq id no:360)；lpgglspw(seq id no:361)；mglfseag(seq id no:362)；splplrvp(seq id no:363)；rmhlrslg(seq id no:364)；laaplgll(seq id no:365)；avgllapp(seq id no:366)；llapshra(seq id no:367)；paglwldp(seq id no:368)；issglss(seq id no:369)；issgl(seq id no:480)；issglls(seq id no:481)；issgll(seq id no:482)；和/或vhmplgflgp(seq id no:411)。
14、在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列issgllss(seq id no:20)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列qnqalrma(seq id no:21)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列aqnllgmv(seq id no:351)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列stfpfgmf(seq idno:352)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列pvgytssl(seq id no:353)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列dwlywpgi(seq id no:354)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列miapvayr(seq id no:355)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列rpspmway(seqid no:356)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列watprpmr(seq id no:357)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列frlldwqw(seq id no:358)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列lkaaprwa(seq id no:359)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列gpshlvlt(seq id no:360)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列lpgglspw(seq id no:361)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列mglfseag(seq id no:362)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列splplrvp(seq id no:363)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列rmhlrslg(seq id no:364)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列laaplgll(seq id no:365)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列avgllapp(seq id no:366)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列llapshra(seq id no:367)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列paglwldp(seq id no:368)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列issglss(seq idno:369)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列vhmplgflgp(seq id no:411)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列issgl(seq id no:480)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列issglls(seq id no:481)。在一些实施方案中，cm1包含氨基酸序列issgll(seq idno:482)。
15、在一些实施方案中，cm2是至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物。在一些实施方案中，sp选自u-型纤溶酶原激活物(upa，也称为尿激酶)、matriptase(本文也称为mt-sp1或mtsp1)及其组合。通过非限制性实例，切割本文所述的cm2的其它sp的实例包括活化蛋白c；组织蛋白酶a；组织蛋白酶g；糜蛋白酶；凝血因子蛋白酶，诸如例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia；弹性蛋白酶；颗粒酶b；guanidinobenzoatase；htra1；人中性粒细胞弹性蛋白酶；乳铁蛋白；marapsin；ns3/4a；pace4；纤溶酶；psa；tpa；凝血酶；类胰蛋白酶；ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(ttsp)，诸如例如desc1、dpp-4、fap、hepsin、matriptase-2、tmprss2、tmprss3和/或tmprss4。
16、例如，合适的cm2由至少一种丝氨酸蛋白酶切割且包括序列tgrgpswv(seq id no:370)；sargpsrw(seq id no:371)；targpsfk(seq id no:372)；lsgrsdnh(seq id no:18)；ggwhtgrn(seq id no:373)；htgrsgal(seq id no:374)；pltgrsgg(seq id no:375)；aargpaih(seq id no:376)；rgpafnpm(seq id no:377)；ssrgpayl(seq id no:378)；rgpatpim(seq id no:379)；rgpa(seq id no:380)；lsgrsgnh(seq id no:412)；tstsgrsanprg(seq id no:413)；tsgrsanp(seq id no:414)；sgrsanprg(seq id no:468)；vagrsmrp(seq id no:415)；lsgrsddh(seq id no:547)；lsgrsdih(seq id no:548)；lsgrsdqh(seq id no:549)；lsgrsdth(seq id no:550)；lsgrsdyh(seq id no:551)；lsgrsdnp(seq id no:552)；lsgrsanp(seq id no:553)；lsgrsani(seq id no:554)；和/或lsgrsdni(seq id no:71)。
17、在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列tgrgpswv(seq id no:370)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列sargpsrw(seq id no:371)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列targpsfk(seq id no:372)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdnh(seqid no:18)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列ggwhtgrn(seq id no:373)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列htgrsgal(seq id no:374)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列pltgrsgg(seq id no:375)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列aargpaih(seq id no:376)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列rgpafnpm(seq id no:377)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列ssrgpayl(seq id no:378)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列rgpatpim(seq id no:379)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列rgpa(seq id no:380)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsgnh(seq id no:412)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列tstsgrsanprg(seq id no:413)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列sgrsanprg(seq id no:468)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列tsgrsanp(seq id no:414)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列vagrsmrp(seq id no:415)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsddh(seq id no:547)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdih(seq id no:548)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdqh(seq id no:549)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdth(seq idno:550)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdyh(seq id no:551)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdnp(seq id no:552)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsanp(seq id no:553)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsani(seqid no:554)。在一些实施方案中，cm2包含氨基酸序列lsgrsdni(seq id no:71)。
18、在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdnh(seq id no:1)；issgllssggsggslsgrsdnh(seq id no:2)；avgllappggtstsgrsanprg(seq id no:3)；tstsgrsanprgggavgllapp(seq id no:4)；vhmplgflgpggtstsgrsanprg(seq id no:5)；tstsgrsanprgggvhmplgflgp(seq id no:6)；avgllappgglsgrsdnh(seq id no:7)；lsgrsdnhggavgllapp(seq id no:8)；vhmplgflgpgglsgrsdnh(seq id no:9)；lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:10)；lsgrsdnhggsggsissgllss(seq id no:11)；lsgrsgnhggsggsissgllss(seq id no:12)；issgllssggsggslsgrsgnh(seq id no:13)；lsgrsdnhggsggsqnqalrma(seq id no:14)；qnqalrmaggsggslsgrsdnh(seq id no:15)；lsgrsgnhggsggsqnqalrma(seq id no:16)；qnqalrmaggsggslsgrsgnh(seq id no:17)；issgllsgrsgnh(seq id no:22)；issgllsgrsanprg(seq id no:469)；avgllapptsgrsanprg(seq id no:470)；avgllappsgrsanprg(seq id no:471)；issgllsgrsddh(seq id no:483)；issgllsgrsdih(seq id no:484)；issgllsgrsdqh(seq id no:485)；issgllsgrsdth(seq id no:486)；issgllsgrsdyh(seq id no:487)；issgllsgrsdnp(seq id no:488)；issgllsgrsanp(seq id no:489)；issgllsgrsani(seq id no:490)；avgllappgglsgrsddh(seq id no:515)；avgllappgglsgrsdih(seq id no:516)；avgllappgglsgrsdqh(seq idno:517)；avgllappgglsgrsdth(seq id no:518)；avgllappgglsgrsdyh(seq id no:519)；avgllappgglsgrsdnp(seq id no:520)；avgllappgglsgrsanp(seq id no:521)；avgllappgglsgrsani(seq id no:522)；issgllsgrsdni(seq id no:555)；和/或avgllappgglsgrsdni(seq id no:557)。
19、在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdnh(seq id no:1)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllssggsggslsgrsdnh(seq id no:2)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappggtstsgrsanprg(seq id no:3)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列tstsgrsanprgggavgllapp(seq id no:4)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列vhmplgflgpggtstsgrsanprg(seq id no:5)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列tstsgrsanprgggvhmplgflgp(seq id no:6)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdnh(seq id no:7)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsdnhggavgllapp(seq id no:8)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列vhmplgflgpgglsgrsdnh(seq id no:9)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsdnhggvhmplgflgp(seq id no:10)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsdnhggsggsissgllss(seq id no:11)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsgnhggsggsissgllss(seq id no:12)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllssggsggslsgrsgnh(seq id no:13)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsdnhggsggsqnqalrma(seq id no:14)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列qnqalrmaggsggslsgrsdnh(seq id no:15)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列lsgrsgnhggsggsqnqalrma(seq id no:16)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列qnqalrmaggsggslsgrsgnh(seq id no:17)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsgnh(seq id no:22)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsanprg(seq id no:469)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllapptsgrsanprg(seq id no:470)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappsgrsanprg(seq id no:471)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsddh(seq id no:483)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdih(seq id no:484)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdqh(seq id no:485)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdth(seq id no:486)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdyh(seq id no:487)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdnp(seq id no:488)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsanp(seq id no:489)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsani(seq id no:490)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsddh(seq id no:515)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdih(seq id no:516)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdqh(seq id no:517)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdth(seq id no:518)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdyh(seq id no:519)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdnp(seq id no:520)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsanp(seq id no:521)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsani(seq id no:522)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列issgllsgrsdni(seq id no:555)。在一些实施方案中，cm1-cm2底物包括序列avgllappgglsgrsdni(seq id no:557)。
20、在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的从n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2-ab、ab-cm2-cm1-mm、mm-cm2-cm1-ab或ab-cm1-cm2-mm。
21、在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(lp1)和第二连接肽(lp2)，且未切割状态下的抗体具有如下的从n-端至c-端的结构排列：mm1-lp1-cm1-cm2-lp2-ab、ab-lp2-cm2-cm1-lp1-mm、mm1-lp1-cm2-cm1-lp2-ab或ab-lp2-cm1-cm2-lp1-mm。在一些实施方案中，lp1和lp2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
22、在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括掩蔽部分(mm)和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。
23、在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm2和掩蔽部分(mm)之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。
24、在一些实施方案中，lp'是gg。在一些实施方案中，lp'是ggsggs(seq id no:350)。
25、在一些实施方案中，lp1或lp2中的至少一种包含选自以下的氨基酸序列：(gs)n、(ggs)n、(gsggs)n(seq id no:381)和(gggs)n(seq id no:382)，其中n是至少1的整数。
26、在一些实施方案中，lp1或lp2中的至少一种包含选自以下的氨基酸序列：ggsg(seq id no:383)、ggsgg(seq id no:384)、gsgsg(seq id no:385)、gsggg(seq id no:386)、gggsg(seq id no:387)和gsssg(seq id no:388)。
27、在一些实施方案中，lp1包含氨基酸序列gssggsggsggsg(seq id no:389)、gssggsggsgg(seq id no:390)、gssggsggsggs(seq id no:391)、gssggsggsggsgggs(seqid no:392)、gssggsggsg(seq id no:393)或gssggsggsgs(seq id no:394)。
28、在一些实施方案中，lp2包含氨基酸序列gss、ggs、gggs(seq id no:395)、gssgt(seq id no:396)或gssg(seq id no:397)。
29、在一些实施方案中，ab对于结合靶标具有约100nm或更低的解离常数。
30、在一些实施方案中，可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)。在一些实施方案中，ab是全长抗体。在一些实施方案中，ab是免疫活性片段。在一些实施方案中，ab是抗原结合片段。在一些实施方案中，ab是单克隆抗体、结构域抗体、单链、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单一结构域重链抗体或单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，这样的ab是小鼠、其它啮齿动物、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
31、在一些实施方案中，mmp蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，mmp蛋白酶切割抗体中的cm1。在一些实施方案中，sp蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，sp蛋白酶切割抗体中的cm2底物。在一些实施方案中，mmp蛋白酶和/或sp蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，mmp蛋白酶和/或sp蛋白酶切割抗体中的cm1-cm2底物。在一些实施方案中，mmp蛋白酶和sp蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，mmp蛋白酶和sp蛋白酶中的至少一种切割抗体中的cm1-cm2底物。
32、在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列和cm2底物序列各自独立地是最多达15个氨基酸长的多肽。
33、在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何动物多肽序列)基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何人多肽序列基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何动物多肽序列)具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm1底物序列是至少一种mmp的底物，且包含与被相同的mmp蛋白酶自然切割的任何人多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。
34、在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的sp蛋白酶自然切割的任何动物多肽序列)基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与被相同的sp蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与被相同的sp蛋白酶自然切割的任何人多肽序列基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的sp蛋白酶自然切割的任何动物多肽序列)具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与被相同的sp蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中，cm1-cm2底物的cm2底物序列是至少一种sp的底物，且包含与被相同的sp蛋白酶自然切割的任何人多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。
35、在一些实施方案中，cm1-cm2底物包含选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557。在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，以及结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)和降低ab的抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力的掩蔽部分(mm)。
36、在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和包含本文公开的抗jagged抗体的氨基酸序列的抗jagged抗体。在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和具有包含氨基酸序列seq id no:162或seq id no:164的轻链和包含氨基酸序列seq id no:67或seqid no:163的重链的抗体。
37、在一些实施方案中，cm1-cm2包括在具有选自seq id no:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列和seq idno:67的重链氨基酸序列的可活化抗体中。
38、在一些实施方案中，cm1-cm2包括在具有选自seq id no:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列和seq idno:163的重链氨基酸序列的可活化抗体中。
39、在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和包含本文公开的抗egfr抗体的氨基酸序列的抗egfr抗体。在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和具有包含氨基酸序列seq id no:111的轻链和包含氨基酸序列seq id no:108、seq id no:109或seq idno:110的重链的抗体。
40、在一些实施方案中，cm1-cm2包括在具有选自seq id no:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列和seq idno:108的重链氨基酸序列的可活化抗体中。
41、在一些实施方案中，cm1-cm2包括在具有选自seq id no:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列和seq idno:109的重链氨基酸序列的可活化抗体中。
42、在一些实施方案中，cm1-cm2包括在具有选自seq id no:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列和seq idno:110的重链氨基酸序列的可活化抗体中。
43、在一些实施方案中，cm1-cm2底物也是至少一种额外蛋白酶的底物。
44、在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶是与切割cm1的mmp蛋白酶不同的mmp蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶是选自以下的mmp蛋白酶：mmp1；mmp2；mmp3；mmp7；mmp8；mmp9；mmp10；mmp11；mmp12；mmp13；mmp14；mmp15；mmp16；mmp17；mmp19；mmp20；mmp23；mmp24；mmp26；和mmp27。
45、在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶是与切割cm2的sp蛋白酶不同的sp蛋白酶。在一些实施方案中，所述至少一种额外sp蛋白酶选自upa；matriptase；活化蛋白c；组织蛋白酶a；组织蛋白酶g；糜蛋白酶；凝血因子蛋白酶，诸如例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia；弹性蛋白酶；颗粒酶b；guanidinobenzoatase；htra1；人中性粒细胞弹性蛋白酶；乳铁蛋白；marapsin；ns3/4a；pace4；纤溶酶；psa；tpa；凝血酶；类胰蛋白酶；ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(ttsp)，诸如例如desc1、dpp-4、fap、hepsin、matriptase-2、tmprss2、tmprss3和/或tmprss4。
46、在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶选自表6中所示的那些。
47、表6：示例性蛋白酶和/或酶
48、
49、本发明还提供包括至少第一cm1和第二cm2且与试剂缀合的抗体。在一些实施方案中，第一cm1和第二cm2各自是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其未切割状态下具有如下的从n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2-ab-试剂、试剂-ab-cm2-cm1-mm、mm-cm2-cm1-ab-试剂或试剂-ab-cm1-cm2-mm。在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其未切割状态下具有如下的从n-端至c-端的结构排列：试剂-mm-cm1-cm2-ab、ab-cm2-cm1-mm-试剂、试剂-mm-cm2-cm1-ab或ab-cm1-cm2-mm-试剂。在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其未切割状态下具有如下的从n-端至c-端的结构排列：试剂-mm-cm1-cm2-ab-试剂、试剂-ab-cm2-cm1-mm-试剂、试剂-mm-cm2-cm1-ab-试剂或试剂-ab-cm1-cm2-mm-试剂。
50、在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩蔽部分(mm)、第一连接肽(lp1)和第二连接肽(lp2)，且未切割状态下的抗体具有如下的从n-端至c-端的结构排列：mm1-lp1-cm1-cm2-lp2-ab-试剂、试剂-ab-lp2-cm2-cm1-lp1-mm、mm1-lp1-cm2-cm1-lp2-ab-试剂或试剂-ab-lp2-cm1-cm2-lp1-mm。在一些实施方案中，lp1和lp2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
51、在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩蔽部分(mm)、第一连接肽(lp1)和第二连接肽(lp2)，且未切割状态下的抗体具有如下的从n-端至c-端的结构排列：试剂-mm1-lp1-cm1-cm2-lp2-ab、ab-lp2-cm2-cm1-lp1-mm-试剂、试剂-mm1-lp1-cm2-cm1-lp2-ab或ab-lp2-cm1-cm2-lp1-mm-试剂。在一些实施方案中，lp1和lp2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
52、在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩蔽部分(mm)、第一连接肽(lp1)和第二连接肽(lp2)，且未切割状态下的抗体具有如下的从n-端至c-端的结构排列：试剂-mm1-lp1-cm1-cm2-lp2-ab-试剂、试剂-ab-lp2-cm2-cm1-lp1-mm-试剂、试剂-mm1-lp1-cm2-cm1-lp2-ab-试剂或试剂-ab-lp2-cm1-cm2-lp1-mm-试剂。在一些实施方案中，lp1和lp2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
53、在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括掩蔽部分(mm)和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括mm和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和ab之间的连接肽(lp”')。
54、在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm2和掩蔽部分(mm)之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)和cm1和cm2之间的连接肽(lp')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括ab和cm1之间的连接肽(lp”)、cm1和cm2之间的连接肽(lp')和cm2和mm之间的连接肽(lp”')。
55、在一些实施方案中，lp'是gg。在一些实施方案中，lp'是ggsggs(seq id no:350)。
56、在一些实施方案中，lp1或lp2中的至少一种包含选自以下的氨基酸序列：(gs)n、(ggs)n、(gsggs)n(seq id no:381)和(gggs)n(seq id no:382)，其中n是至少1的整数。
57、在一些实施方案中，lp1或lp2中的至少一种包含选自以下的氨基酸序列：ggsg(seq id no:383)、ggsgg(seq id no:384)、gsgsg(seq id no:385)、gsggg(seq id no:386)、gggsg(seq id no:387)和gsssg(seq id no:388)。
58、在一些实施方案中，lp1包含氨基酸序列gssggsggsggsg(seq id no:389)、gssggsggsgg(seq id no:390)、gssggsggsggs(seq id no:391)、gssggsggsggsgggs(seqid no:392)、gssggsggsg(seq id no:393)或gssggsggsgs(seq id no:394)。
59、在一些实施方案中，lp2包含氨基酸序列gss、ggs、gggs(seq id no:395)、gssgt(seq id no:396)或gssg(seq id no:397)。
60、在一些实施方案中，cm1-cm2底物连接或以其它方式附接至抗体。例如，cm1-cm2用于将一个或多个试剂连接至结合给定靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，使得当暴露于mmp和/或sp时cm1-cm2被切割，且从ab释放试剂。示例性靶标包括但不限于表1中所示的靶标。示例性ab包括但不限于表2中所示的抗体。
61、在一些实施方案中，ab对于结合靶标具有约100nm或更低的解离常数。
62、在一些实施方案中，抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合靶标的抗体或其免疫活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单一结构域重链抗体或单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，这样的结合靶标的抗体或其免疫活性片段是小鼠、其它啮齿动物、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
63、在一些实施方案中，mm与ab结合的解离常数不大于ab与靶标的解离常数。
64、在一些实施方案中，在切割状态下，mm不干扰ab结合靶标或不与ab竞争结合靶标。
65、在一些实施方案中，mm是约2-40个氨基酸长的多肽。例如，mm是最多达约40个氨基酸长的多肽。
66、在一些实施方案中，mm多肽序列与ab的任何天然结合配偶体的多肽序列不同。在一些实施方案中，mm多肽序列与ab的任何天然结合配偶体具有不多于50％的同一性。在一些实施方案中，mm多肽序列与ab的任何天然结合配偶体具有不多于40％、30％、25％、20％、15％或10％同一性。
67、在一些实施方案中，与ab或可活化抗体的ab缀合的试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。如本文所用，毒素的片段是保留毒性活性的片段。在一些实施方案中，试剂经由可切割接头与ab缀合。在一些实施方案中，试剂经由包括至少一种cm1-cm2底物序列的接头与ab缀合。在一些实施方案中，试剂经由不可切割接头与ab缀合。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸损伤剂，诸如dna烷化剂或dna嵌入剂，或其它dna损伤剂。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀e或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀e(mmae)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀d(mmad)。在一些实施方案中，试剂是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试剂是dm1或dm4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂二聚体。
68、在一些实施方案中，试剂是抗炎剂。
69、在一些实施方案中，抗体和/或可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。
70、在一些实施方案中，缀合的抗体和/或缀合的可活化抗体包括可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在一些实施方案中，成像剂包含放射性同位素。在一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(yfp)、青色荧光蛋白(cfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、修饰的红色荧光蛋白(mrfp)、红色荧光蛋白tdimer2(rfp tdimer2)、hcred或铕衍生物。在一些实施方案中，发光标记包含n-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。在一些实施方案中，标记包含alexa标记，诸如alex 680或alexa 750。在一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或一种或多种半抗原。
71、在一些实施方案中，可活化抗体的抗体和/或ab天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，ab可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
72、在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体是多特异性的，本文中被称为多特异性抗体和/或缀合的多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或缀合的多特异性抗体是双特异性或三功能性的。在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体被配制为前双特异性t-细胞接合者(前bite)分子的一部分。在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体被配制为前嵌合抗原受体(前car)修饰的t-细胞或其它工程改造的受体或其它免疫效应细胞、诸如car修饰的nk细胞的一部分。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前嵌合抗原受体(car)修饰的t-细胞的一部分。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前嵌合抗原受体(car)修饰的nk细胞的一部分。
73、在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是单特异性的。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是多特异性的，在本文中被称为多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。如本文所用，除非另有说明，术语诸如“可活化抗体”及其所有语法变体旨在涵盖但不限于其中可活化抗体是本发明的多特异性可活化抗体的实施方案。如本文所用，除非另有说明，术语诸如“缀合的可活化抗体”及其所有语法变体旨在涵盖但不限于其中缀合的可活化抗体是本发明的缀合的多特异性可活化抗体的实施方案。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体是双特异性或三功能性的。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前双特异性t-细胞接合者(前bite)分子的一部分。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前嵌合抗原受体(前car)修饰的t-细胞或其它工程改造的受体的一部分。
74、在一些实施方案中，本文所述的抗体、抗体缀合物、可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合使用。合适的额外试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例如，可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。
75、在一些实施方案中，可活化抗体是多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其识别两种或更多种不同的抗原或表位，且包括至少一个掩蔽部分(mm)，所述掩蔽部分与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接，使得mm的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。在一些实施方案中，mm经由起至少一种mmp蛋白酶和至少一种sp蛋白酶的底物的作用的cm1-cm2底物与多特异性抗体的抗原或表位结合结构域偶联。本文提供的可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时展现与相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。
76、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列和vh cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列、vh cdr2序列和vhcdr3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列syams(seq id no:398)的vh cdr1序列；至少包括氨基酸序列sidpegrqtyyadsvkg(seq id no:399)的vh cdr2序列；和至少包括氨基酸序列diggrsafdy(seq id no:400)的vh cdr3序列，及其组合。
77、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vl cdr1序列、vl cdr2序列和vlcdr3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列rasqsissy(seq id no:401)的vl cdr1序列；至少包括氨基酸序列aasslqs(seq id no:402)的vl cdr2序列；至少包括氨基酸序列qqtvvappl(seq id no:403)的vl cdr3序列，及其组合。
78、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列和vh cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列、vh cdr2序列和vhcdr3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列syams(seq id no:398)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr1序列；包括与氨基酸序列sidpegrqtyyadsvkg(seq id no:399)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr2序列；包括与氨基酸序列diggrsafdy(seq id no:400)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr3序列，及其组合。
79、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vl cdr1序列、vl cdr2序列和vlcdr3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列rasqsissy(seq id no:401)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr1序列；包括与氨基酸序列aasslqs(seq id no:402)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr2序列；和包括与氨基酸序列qqtvvappl(seq id no:403)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr3序列，及其组合。
80、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列、vh cdr3序列、vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列至少包括氨基酸序列syams(seq id no:398)；vh cdr2序列至少包括氨基酸序列sidpegrqtyyadsvkg(seq id no:399)；vh cdr3序列至少包括氨基酸序列diggrsafdy(seq id no:400)；vl cdr1序列至少包括氨基酸序列rasqsissy(seq id no:401)；vl cdr2序列至少包括氨基酸序列aasslqs(seq id no:402)；且vl cdr3序列至少包括氨基酸序列qqtvvappl(seq id no:403)。
81、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合jagged靶标，例如，jagged 1和/或jagged 2，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列、vh cdr3序列、vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列包括与氨基酸序列syams(seq id no:398)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vh cdr2序列包括与氨基酸序列sidpegrqtyyadsvkg(seq id no:399)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vh cdr3序列包括与氨基酸序列diggrsafdy(seq id no:400)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vl cdr1序列包括与氨基酸序列rasqsissy(seq id no:401)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vl cdr2序列包括与氨基酸序列aasslqs(seq id no:402)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；且vl cdr3序列包括与氨基酸序列qqtvvappl(seq id no:403)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
82、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合表皮生长因子受体(egfr)，且含有vh cdr1序列、vhcdr2序列和vh cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列、vh cdr2序列和vh cdr3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列nygvh(seq id no:404)的vh cdr1序列；至少包括氨基酸序列viwsggntdyntpfts(seq id no:405)的vh cdr2序列；至少包括氨基酸序列altyydyefay(seq id no:406)的vh cdr3序列；及其组合。
83、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合egfr，且含有vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列rasqsigtnih(seq id no:407)的vl cdr1序列；至少包括氨基酸序列kyasesis(seq idno:408)的vl cdr2序列；和至少包括氨基酸序列qqnnnwptt(seq id no:409)的vl cdr3序列，及其组合。
84、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合egfr，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列和vh cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列、vh cdr2序列和vh cdr3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列nygvh(seq id no:404)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr1序列；包括与氨基酸序列viwsggntdyntpfts(seq idno:405)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr2序列；包括与氨基酸序列altyydyefay(seq id no:406)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vh cdr3序列；及其组合。
85、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合egfr，且含有vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列rasqsigtnih(seq id no:407)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr1序列；包括与氨基酸序列kyasesis(seq idno:408)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr2序列；和包括与氨基酸序列qqnnnwptt(seq id no:409)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的vl cdr3序列，及其组合。
86、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合egfr，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列、vh cdr3序列、vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列至少包括氨基酸序列nygvh(seq id no:404)；vh cdr2序列至少包括氨基酸序列viwsggntdyntpfts(seq idno:405)；vh cdr3序列至少包括氨基酸序列altyydyefay(seq id no:406)；vl cdr1序列至少包括氨基酸序列rasqsigtnih(seq id no:407)；vl cdr2序列至少包括氨基酸序列kyasesis(seq id no:408)；且vl cdr3序列至少包括氨基酸序列qqnnnwptt(seq id no:409)。
87、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(ab1)，其特异性结合egfr，且含有vh cdr1序列、vh cdr2序列、vh cdr3序列、vl cdr1序列、vl cdr2序列和vl cdr3序列的组合，其中vh cdr1序列包括与氨基酸序列nygvh(seq id no:404)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vh cdr2序列包括与氨基酸序列viwsggntdyntpfts(seq id no:405)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vh cdr3序列包括与氨基酸序列altyydyefay(seq id no:406)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vl cdr1序列包括与氨基酸序列rasqsigtnih(seq id no:407)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；vl cdr2序列包括与氨基酸序列kyasesis(seq idno:408)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；且vl cdr3序列包括与氨基酸序列qqnnnwptt(seq id no:409)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。
88、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选自seq idno:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和包含本文公开的抗jagged抗体的氨基酸序列的抗jagged抗体。在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和具有包含氨基酸序列seq id no:162或seq idno:164的轻链和包含氨基酸序列seq id no:67或seq id no:163的重链的抗体。
89、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括seq id no:67的重链氨基酸序列和选自seq id no:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列。
90、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选自seq idno:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和包含本文公开的抗egfr抗体的氨基酸序列的抗egfr抗体。在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选自seq id no:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的cm1-cm2底物，和具有包含氨基酸序列seq id no:111的轻链和包含氨基酸序列seq id no:108、seq id no:109或seq id no:110的重链的抗体。
91、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括seq id no:108的重链氨基酸序列和选自seq id no:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列。
92、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括与seq idno:67的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与选自seq id no:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
93、在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，至少包括与seq idno:108的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与选自seq id no:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
94、在一些实施方案中，可活化抗体还包括与ab缀合的试剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂经由接头与ab缀合。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸损伤剂，诸如dna烷化剂或dna嵌入剂，或其它dna损伤剂。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，试剂经由包括至少一种cm1-cm2底物序列的接头与ab缀合。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀e或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀e(mmae)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀d(mmad)。在一些实施方案中，试剂是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试剂是dm1或dm4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是加利车霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂二聚体。
95、在一些实施方案中，试剂是抗炎剂。
96、在一些实施方案中，可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。
97、在一些实施方案中，缀合的抗体包括可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在一些实施方案中，成像剂包含放射性同位素。在一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(yfp)、青色荧光蛋白(cfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、修饰的红色荧光蛋白(mrfp)、红色荧光蛋白tdimer2(rfp tdimer2)、hcred或铕衍生物。在一些实施方案中，发光标记包含n-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。在一些实施方案中，标记包含alexa标记，诸如alex680或alexa750。在一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或一种或多种半抗原。
98、在一些实施方案中，可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽经由间隔区与可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区在信号肽不存在的情况下与可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区直接连接至可活化抗体的mm。在一些实施方案中，间隔区以间隔区-mm-cm1-cm2底物-ab的n-端至c-端的结构排列直接连接至可活化抗体的mm。直接连接至可活化抗体的mm的n-端的间隔区的实例是选自以下的氨基酸序列：qgqsgq(seqid no:410)、gqsgq(seq id no:416)、qsgq(seq id no:417)、sgq(seq id no:418)、gq和q。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列qgqsgq(seq id no:410)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列gqsgq(seq id no:416)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列qsgq(seq id no:417)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列sgq(seq id no:418)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列gq。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列q。
99、在一些实施方案中，可活化抗体的ab天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，ab可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
100、在一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期比相应的抗体的血清半衰期更长；例如，可活化抗体的pk比相应的抗体的pk更长。在一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期类似于相应的抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少8天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3小时。
101、本发明还提供包括可活化抗体的组合物和方法，所述可活化抗体包括特异性结合给定靶标的抗体或抗体片段(ab)，其中ab与降低ab1结合其靶标的能力的掩蔽部分(mm)偶联。在一些实施方案中，可活化抗体还包括作为至少一种mmp和至少一种sp的底物的cm1-cm2底物。本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至ab中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害可活化抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至ab中的一个或多个半胱氨酸残基，而不减少或以其它方式干扰mm内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生可活化抗体，其与一种或多种试剂，例如多种治疗剂、诊断剂和/或预防剂中的任一种缀合，例如，在一些实施方案中，没有任何试剂与可活化抗体的mm缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗体，其中mm保留有效且有效地掩蔽未切割状态下的可活化抗体的ab的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗体，其中可活化抗体在可切割cm1-cm2底物的mmp存在的情况下仍被活化，即切割。
102、可活化抗体具有试剂的至少一个缀合点，但在本文提供的方法和组合物中，少于所有可能的缀合点可用于与试剂缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是涉及二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是涉及链间二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是涉及链间硫化物键的硫原子，但不是涉及链内二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或含有硫原子的其它氨基酸残基的硫原子。这样的残基可以天然存在于抗体结构中，或者可以通过定点诱变、化学转化或错误并入非天然氨基酸而并入抗体中。
103、还提供了制备在ab中具有一个或多个链间二硫键和在mm中具有一个或多个链内二硫键的可活化抗体的缀合物的方法，并且提供与游离硫醇反应的药物。该方法通常包括用还原剂(诸如例如tcep)部分还原可活化抗体中的链间二硫键；和将与游离巯基反应的药物与部分还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指其中可活化抗体与还原剂接触且少于所有二硫键，例如少于所有可能的缀合位点被减少的情况。在一些实施方案中，少于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％的所有可能的缀合位点被还原。
104、在一些实施方案中，提供了将试剂例如药物还原和缀合至可活化抗体、导致试剂放置的选择性的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原可活化抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其它非ab部分中的任何缀合位点不被还原，并将该试剂缀合至ab中的链间硫醇。选择缀合位点以便允许试剂的期望放置，以允许在期望的位点发生缀合。还原剂例如为tcep。通过鉴定产生其中mm保留有效和有效地掩蔽未切割状态下的可活化抗体的ab的能力的缀合的可活化抗体的条件来鉴定还原反应条件，诸如例如还原剂与可活化抗体的比率，温育时间，温育期间的温度，还原反应溶液的ph等。还原剂与可活化抗体的比率将根据可活化抗体而变化。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
105、在一些实施方案中，提供了还原可活化抗体的ab中的链间二硫键和将试剂(例如，含硫醇的试剂，诸如药物)缀合至所得链间硫醇以将试剂选择性定位在ab上的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原ab以形成至少两个链间硫醇，而不在可活化抗体中形成所有可能的链间硫醇；和将所述试剂缀合至部分还原的ab的链间硫醇。例如，以还原剂:可活化抗体的期望比率将可活化抗体的ab在约37℃下部分还原约1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
106、含硫醇的试剂可以是例如半胱氨酸或n-乙酰半胱氨酸。还原剂可以是例如tcep。在一些实施方案中，可以在缀合之前使用例如柱色谱、透析或渗滤纯化还原的可活化抗体。在一些实施方案中，在部分还原后和缀合之前不纯化还原的抗体。
107、本发明还提供了部分还原的可活化抗体，其中可活化抗体中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，抑制未切割状态下的可活化抗体的ab与靶标的结合的掩蔽部分(mm)，和与ab偶联的cm1-cm2底物，其中cm1-cm2底物是起至少一种mmp和一种sp的底物的作用的多肽。在一些实施方案中，mm经由cm1-cm2底物与ab偶联。在一些实施方案中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，可活化抗体内的mm的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2底物-ab或ab-cm1-cm2底物-mm。在一些实施方案中，还原剂是tcep。
108、本发明还提供了部分还原的可活化抗体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体，其中可活化抗体中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰或以其它方式损害可活化抗体的活性和/或效力，其中可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，抑制未切割状态下的可活化抗体的ab与靶标的结合的掩蔽部分(mm)，和与ab偶联的cm1-cm2底物，且cm1-cm2底物是起蛋白酶的底物作用的多肽。通过非限制性实例，可活化抗体的活性和/或效力是可活化抗体的掩蔽活性、活化和/或活化的可活化抗体的结合活性。在一些实施方案中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，可活化抗体内的mm的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2底物-ab或ab-cm1-cm2底物-mm。在一些实施方案中，还原剂是tcep。
109、本发明还提供了缀合的可活化抗体，其包括与单甲基阿里他汀d(mmad)有效负载连接的可活化抗体，其中可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，抑制未切割状态下的可活化抗体的ab与靶标的结合的掩蔽部分(mm)，和与ab偶联的cm1-cm2底物，且其中cm1-cm2底物是起至少一种mmp蛋白酶和至少一种sp蛋白酶的底物的作用的多肽。
110、在一些实施方案中，可以使用几种用于将试剂附接至ab的方法中的任一种来缀合mmad-缀合的可活化抗体：(a)附接至ab的碳水化合物部分，或(b)附接至ab的巯基，或(c)附接至ab的氨基，或(d)附接至ab的羧酸酯基团。
111、在一些实施方案中，mmad有效负载经由接头与ab缀合。在一些实施方案中，mmad有效负载经由接头与ab中的半胱氨酸缀合。在一些实施方案中，mmad有效负载经由接头与ab中的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，mmad有效负载经由接头与ab中的另一残基(诸如本文公开的那些残基)缀合。在一些实施方案中，所述接头是含硫醇的接头。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头选自表5和6中所示的接头。在一些实施方案中，可活化抗体和mmad有效载荷经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方案中，可活化抗体和mmad有效载荷经由马来酰亚胺peg-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方案中，可活化抗体和mmad有效载荷经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施方案中，可活化抗体和mmad有效载荷经由马来酰亚胺peg-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施方案中，使用本文公开的部分还原和缀合技术将mmad有效载荷与ab缀合。
112、本发明还提供了包括本文提供的cm1-cm2底物序列中的一种或多种的多肽和其它较大分子。作为非限制性实例，本文提供的cm1-cm2底物序列可用于前药组合物及其使用方法中。本文提供的这些cm1-cm2底物序列也可用于探针和其它检测剂及其使用方法中。例如，本文提供的cm1-cm2底物序列可以与荧光和其它猝灭剂结合使用以产生检测剂，诸如成像剂和/或其它诊断剂。本领域普通技术人员将理解本文提供的cm1-cm2底物序列可用于本领域使用可由至少一种mmp和至少一种sp切割的底物的任何组合物和/或方法中。
113、本发明还提供了编码本文所述的抗体和/或可活化抗体的分离的核酸分子，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本发明提供了通过在导致表达抗体和/或可活化抗体的条件下培养细胞来产生抗体和/或可活化抗体的方法，其中所述细胞包含这样的载体。
114、本发明提供了通过如下制造本发明的结合给定靶标的缀合的抗体的方法：(a)在导致表达所述抗体的条件下培养包含编码所述抗体的核酸构建体的细胞，(i)其中所述抗体包括cm1-cm2底物，且(ii)其中所述cm1-cm2底物是起基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的底物作用的多肽；(b)回收所述抗体；和(c)将回收的抗体与一种或多种额外试剂缀合。
115、本发明还提供了通过如下制造本发明的在活化状态下结合给定靶标的可活化抗体的方法：(a)在导致表达所述可活化抗体的条件下培养包含编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包含掩蔽部分(mm)、cm1-cm2底物和特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，(i)其中cm1-cm2底物是起mmp和sp的底物的作用的多肽；且(ii)其中cm1-cm2底物位于可活化抗体中，使得在未切割状态下，mm干扰ab与靶标的特异性结合，且在切割状态下，mm不干扰ab特异性结合靶标或竞争ab特异性结合靶标；和(b)回收可活化抗体。
116、本发明还提供了通过如下制造本发明的在活化状态下结合给定靶标的缀合的可活化抗体的方法：(a)在导致表达所述可活化抗体的条件下培养包含编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包含掩蔽部分(mm)、cm1-cm2底物和特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，(i)其中cm1-cm2底物是起mmp和sp的底物的作用的多肽；且(ii)其中cm1-cm2底物位于可活化抗体中，使得在未切割状态下，mm干扰ab与靶标的特异性结合，且在切割状态下，mm不干扰ab特异性结合靶标或竞争ab特异性结合靶标；(b)回收所述可活化抗体；和(c)将回收的抗体与一种或多种额外试剂缀合。
117、本发明提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预防靶标相关的疾病、延迟靶标相关的疾病的进展、治疗靶标相关的疾病、减轻靶标相关的疾病的症状或以其它方式改善靶标相关的疾病的方法。
118、本发明提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预防炎症和/或炎性病症、延迟炎症和/或炎性病症的进展、治疗炎症和/或炎性病症、减轻炎症和/或炎性病症的症状或以其它方式改善炎症和/或炎性病症的方法。本发明还提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预防癌症、延迟癌症的进展、治疗癌症、减轻癌症的症状或以其它方式改善癌症的方法。本发明还提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预防自身免疫学疾病、延迟自身免疫学疾病的进展、治疗自身免疫学疾病、减轻自身免疫学疾病的症状或以其它方式改善自身免疫学疾病的方法。
119、在这些方法和用途的任何实施方案中使用的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以在疾病的任何阶段施用。例如，这样的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以施用于患有任何阶段的癌症(从早期至转移)的患者。术语受试者和患者在本文可互换使用。
120、在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物。在一些实施方案中，受试者是兽医护理的动物。
121、将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体及其治疗制剂施用于患有或易患异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者。使用本领域已知的各种方法中的任一种鉴定患有或易患异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者。例如，使用各种临床和/或实验室测试(诸如身体检查和血液、尿液和/或粪便分析)中的任一种来鉴定患有癌症或其它肿瘤病况的受试者以评估健康状况。例如，使用各种临床和/或实验室测试(诸如身体检查和/或体液分析，例如血液、尿液和/或粪便分析)中的任一种来鉴定患有炎症和/或炎性病症的受试者，以评估健康状况。
122、如果实现各种实验室或临床目标中的任一种，则将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于患有与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症被认为是成功的。例如，如果与疾病或病症相关的症状中的一种或多种得到缓解、减少、抑制或不进展至进一步(即更差)状态，则将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于患有与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症被认为是成功的。如果疾病或病症进入缓解或不进展至进一步(即更差)状态，则将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于患有与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症被认为是成功的。
123、在一些实施方案中，本文所述的抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合使用。合适的额外试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例如，抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。
124、在一些实施方案中，所述额外试剂是化学治疗剂，诸如选自多西他赛、紫杉醇、abraxane(即，白蛋白缀合的紫杉醇)、多柔比星、奥沙利铂、卡铂、顺铂、伊立替康和吉西他滨的化学治疗剂。
125、在一些实施方案中，所述额外试剂是检查点抑制剂、激酶抑制剂、靶向肿瘤微环境中的抑制剂的试剂和/或t-细胞或nk激动剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是单独或与其它额外试剂诸如化学治疗剂或抗肿瘤剂组合的放射疗法。在一些实施方案中，所述额外试剂是疫苗、肿瘤病毒和/或dc-活化剂，诸如，通过非限制性实例的方式，toll样受体(tlr)激动剂和/或α-cd40。在一些实施方案中，所述额外试剂是设计为经由adcc或经由与毒素的直接缀合(例如，抗体药物缀合物(adc))杀死肿瘤的肿瘤靶向抗体。
126、在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是选自ctla-4、lag-3、pd-1、pd-1、tigit、tim-3、b7h4、btla和vista的靶标的抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂选自b-rafi、meki和btk抑制剂，诸如依鲁替尼。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境抑制剂选自ido抑制剂、α-csf1r抑制剂、α-ccr4抑制剂、tgf-β、骨髓衍生的抑制细胞或t调节细胞。在一些实施方案中，所述激动剂选自ox40、gitr、cd137、icos、cd27和hvem。
127、在一些实施方案中，所述抑制剂是ctla-4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是lag-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是pd-1抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是pd-1抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是tigit抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是tim-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是b7h4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是vista抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是b-rafi抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是meki抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是btk抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是ido抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是α-csf1r抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是α-ccr4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是tgf-β。在一些实施方案中，所述抑制剂是骨髓衍生的抑制细胞。在一些实施方案中，所述抑制剂是t调节细胞。
128、在一些实施方案中，所述激动剂是ox40。在一些实施方案中，所述激动剂是gitr。在一些实施方案中，所述激动剂是cd137。在一些实施方案中，所述激动剂是icos。在一些实施方案中，所述激动剂是cd27。在一些实施方案中，所述激动剂是hvem。
129、在一些实施方案中，所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种额外试剂组合施用，所述额外试剂诸如例如化学治疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂。在一些实施方案中，将所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂配制于单一治疗组合物中，且同时施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。可选地，所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂彼此分开，例如，各自配制于分开的治疗组合物中，且同时施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂，或在治疗方案期间在不同的时间施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，在施用额外试剂之后施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，或以交替的方式施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。
130、在一些实施方案中，同时施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，依次施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂，或者在治疗方案期间在不同的时间施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。
131、在一些实施方案中，在治疗期间和/或之后将所述缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体与一种或多种额外试剂组合施用，所述额外试剂诸如(通过非限制性实例的方式)，抗炎剂、免疫抑制剂、化学治疗剂，诸如烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素和/或任何其它核酸损伤剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是紫杉烷，诸如紫杉醇(例如，)。在一些实施方案中，所述额外试剂是抗代谢物，诸如吉西他滨。在一些实施方案中，所述额外试剂是烷化剂，诸如基于铂的化学疗法，诸如卡铂或顺铂。在一些实施方案中，所述额外试剂是靶向试剂，诸如激酶抑制剂，例如索拉非尼或埃罗替尼。在一些实施方案中，所述额外试剂是靶向试剂，诸如另一种抗体，例如单克隆抗体(例如，贝伐单抗)，双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，所述额外试剂是蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米或卡非佐贝。在一些实施方案中，所述额外试剂是免疫调节剂，诸如来那度胺(lenolidominde)或il-2。在一些实施方案中，所述额外试剂是辐射剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是本领域技术人员认为是护理标准的试剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是本领域技术人员众所周知的化学治疗剂。
132、在一些实施方案中，所述额外试剂是抗体、另一缀合的抗体、另一可活化抗体和/或另一缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，所述额外试剂是与第一缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体针对相同的靶标的抗体、另一缀合的抗体、另一可活化抗体和/或另一缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，所述额外试剂是针对与第一缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的靶标不同的靶标的抗体、另一缀合的抗体、另一可活化抗体和/或另一缀合的可活化抗体。
133、在一些实施方案中，同时施用所述缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，所述缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，依次施用所述缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂，或者在治疗方案期间在不同的时间施用所述抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前施用所述抗体和/或缀合的抗体，在施用额外试剂之后施用所述抗体和/或缀合的抗体，或以交替的方式施用所述抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施用所述抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。
134、本发明还提供了用于在各种诊断和/或预防适应症中使用缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的方法和试剂盒。
135、根据本发明的药物组合物可以包括本发明的抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和载体。这些药物组合物可以包括在试剂盒诸如例如诊断试剂盒中。
136、综上，本技术提供了如下具体实施方案：
137、1.一种包含cm1-cm2底物的分离的多肽，所述cm1-cm2底物包含作为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物的至少第一可切割部分(cm1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物的至少第二可切割部分(cm2)。
138、2.实施方案1的分离的多肽，其中cm1和cm2经由连接肽连接。
139、3.实施方案1的分离的多肽，其中cm1和cm2共有至少一个氨基酸残基。
140、4.实施方案1的分离的多肽，其中cm1和cm2彼此直接连接。
141、5.实施方案1-4中任一项的分离的多肽，其中所述cm1-cm2底物包含选自seq idno:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列。
142、6.实施方案1-5中任一项的分离的多肽，其中所述mmp是mmp2、mmp9或mmp14。
143、7.实施方案1-6中任一项的分离的多肽，其中所述sp是upa或matriptase。
144、8.一种分离的多肽，其包含结合靶标的抗体或其抗原结合片段(ab)，以及作为至少一种基质金属蛋白酶(mmp)的底物的至少第一可切割部分(cm1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(sp)的底物的至少第二可切割部分(cm2)。
145、9.实施方案8的分离的多肽，其中cm1和cm2经由连接肽连接。
146、10.实施方案8的分离的多肽，其中cm1和cm2共有至少一个氨基酸残基。
147、11.实施方案8的分离的多肽，其中cm1和cm2彼此直接连接。
148、12.实施方案8-11中任一项的分离的多肽，其中所述cm1-cm2底物包含选自seq idno:1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列。
149、13.实施方案8-12中任一项的分离的多肽，其中所述mmp、sp或mmp和sp两者与靶标共同定位于组织中。
150、14.实施方案8-13中任一项的分离的多肽，其中其抗原结合片段选自fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
151、15.实施方案8-14中任一项的分离的多肽，其中所述ab与所述cm1连接。
152、16.实施方案15的分离的多肽，其中所述ab与所述cm1直接连接。
153、17.实施方案15的分离的多肽，其中所述ab经由连接肽与所述cm1连接。
154、18.实施方案8-14中任一项的分离的多肽，其中所述ab与cm2连接。
155、19.实施方案18的分离的多肽，其中所述ab与cm2直接连接。
156、20.实施方案18的分离的多肽，其中所述ab经由连接肽与所述cm1连接。
157、21.实施方案8-20中任一项的分离的多肽，其中所述mmp是mmp2、mmp9或mmp14。
158、22.实施方案8-21中任一项的分离的多肽，其中所述sp是upa或matriptase。
159、23.实施方案8-22中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含掩蔽部分(mm)。
160、24.实施方案8-23中任一项的分离的多肽，其中所述mm与ab结合的解离常数大于ab与靶标结合的解离常数。
161、25.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述mm是不超过40个氨基酸长的多肽。
162、26.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述mm与所述cm1连接，使得未切割状态下的分离的多肽包含如下的n-端至c-端的结构排列：mm-cm1-cm2-ab或ab-cm2-cm1-mm。
163、27.实施方案26的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含所述mm和所述cm1之间的连接肽。
164、28.实施方案26的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含cm2和所述ab之间的连接肽。
165、29.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含cm1和cm2之间的连接肽。
166、30.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述mm与cm2连接，使得未切割状态下的分离的多肽包含如下的n-端至c-端的结构排列：mm-cm2-cm1-ab或ab-cm1-cm2-mm。
167、31.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含所述mm和cm2之间的连接肽。
168、32.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含cm1和所述ab之间的连接肽。
169、33.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含cm1和cm2之间的连接肽。
170、34.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含第一连接肽(lp1)和第二连接肽(lp2)，且其中未切割状态下的分离的多肽具有如下的n-端至c-端的结构排列：mm-lp1-cm1-cm2-lp2-ab、ab-lp2-cm2-cm1-lp1-mm、mm-lp1-cm2-cm1-lp2-ab或ab-lp2-cm1-cm2-lp1-mm。
171、35.实施方案34的分离的多肽，其中两个连接肽不需要彼此相同。
172、36.实施方案34或35的分离的多肽，其中lp1和lp2各自是约1-20个氨基酸长的肽。
173、37.实施方案34-36中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含cm1和cm2之间的第三连接肽(lp')。
174、38.实施方案23-37中任一项的分离的多肽，其中所述mm的氨基酸序列不同于所述靶标的氨基酸序列，并且与所述ab的天然结合配偶体的氨基酸序列具有不超过10％同一性。
175、39.实施方案23或24的分离的多肽，其中在切割状态下，所述mm不干扰ab结合靶标或不与ab竞争结合靶标。
176、40.实施方案8-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含选自seq idno:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列和包含seq id no:67的重链氨基酸序列。
177、41.实施方案8-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含选自seq idno:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列和包含seq id no:108的重链氨基酸序列。
178、42.实施方案1-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含选自seq idno:420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的氨基酸序列。
179、43.实施方案1-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含选自seq idno:449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的氨基酸序列。
180、实施方案23-43中任一项的分离的多肽，其中所述mmp是mmp2、mmp9或mmp14。
181、44.实施方案23-43中任一项的分离的多肽，其中所述sp是upa或matriptase。
182、45.一种缀合的可活化抗体，其包含与试剂缀合的如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽。
183、46.实施方案45的缀合的可活化抗体，其中所述试剂经由接头与所述ab缀合。
184、47.实施方案46的缀合的可活化抗体，其中所述接头是可切割接头。
185、48.实施方案46的缀合的可活化抗体，其中所述接头是不可切割接头。
186、49.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是毒素或其片段。
187、50.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是微管抑制剂。
188、51.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是核酸损伤剂。
189、52.实施方案49的缀合的可活化抗体，其中所述试剂选自多拉司他汀或其衍生物、阿里他汀或其衍生物、美登木素或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物和加利车霉素或其衍生物。
190、53.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是阿里他汀e或其衍生物。
191、54.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是单甲基阿里他汀e(mmae)。
192、55.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是单甲基阿里他汀d(mmad)。
193、56.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是选自dm1和dm4的美登木素。
194、57.实施方案45的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是可检测部分。
195、58.实施方案57的缀合的可活化抗体，其中所述可检测部分是诊断剂。
196、59.一种药物组合物，其包含如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽和载体。
197、60.实施方案59的药物组合物，其包含额外试剂。
198、61.实施方案60的药物组合物，其中所述额外试剂是治疗剂。
199、62.一种分离的核酸分子，其编码如实施方案1-44中任一项中所述的分离的多肽。
200、63.一种载体，其包含实施方案62的分离的核酸分子。
201、64.一种通过在导致如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽表达的条件下培养细胞来产生抗体或可活化抗体的方法，其中所述细胞包含实施方案62的核酸分子。
202、65.一种制造可活化抗体的方法，所述可活化抗体在活化状态下结合靶标，所述方法包括：
203、(a)培养包含编码如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽的核酸构建体的细胞；和
204、(b)回收所述可活化抗体。
205、66.一种治疗、缓解病症或疾病的症状或延缓病症或疾病的进展的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽、如实施方案45-58中任一项中所述的缀合的可活化抗体或如实施方案59-61中任一项中所述的药物组合物。
206、67.实施方案66的方法，其中所述病症或疾病是癌症。
207、68.实施方案66或实施方案67的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用额外试剂。
208、69.实施方案68的方法，其中所述额外试剂是治疗剂。
1.一种包含cm1-cm2底物的分离的多肽，所述cm1-cm2底物包含作为至少一种基质金属蛋白酶mmp的底物的至少第一可切割部分cm1和作为至少一种丝氨酸蛋白酶sp的底物的至少第二可切割部分cm2，其中所述cm1-cm2底物包含选自seq id no:2和11-13的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述mmp是mmp2、mmp9或mmp14。
3.权利要求1或权利要求2的分离的多肽，其中所述sp是upa或matriptase。
4.一种分离的多肽，其包含结合靶标的抗体或其抗原结合片段ab，和cm1-cm2底物，所述cm1-cm2底物包含作为至少一种基质金属蛋白酶mmp的底物的至少第一可切割部分cm1和作为至少一种丝氨酸蛋白酶sp的底物的至少第二可切割部分cm2，其中所述cm1-cm2底物包含选自seq id no:2和11-13的氨基酸序列。
5.权利要求4的分离的多肽，其中其抗原结合片段选自fab片段、f(ab')2片段、scfv、scab、dab、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
6.权利要求4的分离的多肽，其中所述ab与所述cm1连接。
7.权利要求6的分离的多肽，其中所述ab与所述cm1直接连接。
8.权利要求6的分离的多肽，其中所述ab经由连接肽与所述cm1连接。
9.权利要求4的分离的多肽，其中所述ab与cm2连接。
10.权利要求9的分离的多肽，其中所述ab与cm2直接连接。
