本发明属于生物，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白的纳米抗体及应用。
背景技术：
1、非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)感染引起猪的一种烈性传染病。世界动物卫生组织将非洲猪瘟列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟潜伏期一般为4～19天，根据其临床表现，可分为5种类型，包括最急性型、急性型、亚急性型、慢性型和亚临床型。该病主要通过直接接触传播，也能够通过媒介传播。软蜱是其贮藏宿主和传播媒介，该病毒也是目前已知的唯一一种可经生物学媒介软蜱传播的dna病毒。
2、非洲猪瘟病毒是一种核质大dna病毒，可以分为24个基因型且容易变异，由于基因型不同，基因组长度范围从171,235bp至193,886bp不等，包含151～167个开放阅读框(openreading frame,orf)。2018年我国辽宁省沈阳市首次暴发非洲猪瘟疫情，经测序鉴定该非洲猪瘟病毒毒株为基因ii型。此后，非洲猪瘟迅速传播蔓延，我国逐步监测到基因ii型自然变异和基因缺失毒株。2021年，首次在国内报道了弱毒力的基因i型毒株。自此，我国田间出现非洲猪瘟病毒基因i型与基因ii型毒株共同流行的情况；随后，报道了基因i型与基因ii型重组毒株。目前，流行毒株的复杂化，对我国非洲猪瘟的防控带来了新的挑战。非洲猪瘟病毒特异性核酸的检测在我国早期防控中发挥了非常重要的作用；但由于弱毒株的出现导致排毒时间延后、排毒量相对较低，检测非洲猪瘟病毒核酸有时可能无法检出；而非洲猪瘟病毒特异性的抗体的检测对于弱毒力毒株感染以及耐过猪的筛查非常重要。
3、骆驼科动物血清中hcab重链的可变区为单体结构域，即单域抗体(vhh)，又称纳米抗体(nanobody,nb)，其直径为2.5nm、长度为4nm。nb分子量大小约为15kda，是当前可结合目标抗原的最小抗体。nb具有体积小、分子量小、易于改造、穿透性强、免疫原性低、代谢快等优点。相较于传统大分子量的ig抗体(约150kda)，nb更易于改造；更易识别并结合曲折凹陷等隐蔽处的抗原表位。nb水溶性高且亲和能力强。由于l链的缺失，vh不能与vl通过相互作用结合，使nb的亲水性氨基酸残基暴露，增加了其在水中的溶解度，使其能与水溶性半抗原结合。此外，nb具有更长的cdr1和cdr3氨基酸序列，与抗原的亲和力高于传统的多克隆抗体和单克隆抗体。nb可以在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物细胞表达系统中高水平表达，由于其分子量较小、结构简单，其生产和纯化过程更为简单，且能实现批量制备。纳米抗体独特的分子特性使其在诊断和治疗各种疾病及检测方面展现出良好应用前景。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本发明提供一种抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白纳米抗体kr-6及其制备方法和应用，所述纳米抗体与非洲猪瘟病毒k205r蛋白和非洲猪瘟病毒均具有较高的亲和力，能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗。具体包括以下内容：
2、第一方面，本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白纳米抗体kr-6，所述纳米抗体kr-6的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述纳米抗体kr-6的核酸。
4、优选地，所述核酸序列如sqe id no.2所示。
5、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述第二方面所述的核酸序列。
6、第四方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
7、(i)上述第一方面所述的纳米抗体kr-6；
8、(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp、或其组合。
9、第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的纳米抗体kr-6或上述第四方面所述的免疫偶联物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
10、第六方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述第一方面所述的纳米抗体kr-6。
11、第七方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括上述第一方面所述的纳米抗体kr-6。
12、第八方面，本发明提供了上述第一方面所述的纳米抗体kr-6的制备方法，所述方法包括：
13、(1)合成编码上述第一方面所述纳米抗体kr-6的核苷酸序列；
14、(2)将步骤(1)所述核苷酸序列与载体/质粒连接，构建纳米抗体kr-6的表达载体；
15、(3)将纳米抗体kr-6的表达载体转化细菌，构建重组细胞，进行诱导表达并纯化获得纳米抗体kr-6。
16、优选地，所述纳米抗体kr-6的核苷酸序列如sqe id no.2所示。
17、第九方面，本发明提供了一种扩增编码上述第一方面所述纳米抗体kr-6的核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物为：
18、上游引物f:ccggaattccggatgcatgtgcagctggtggag(seq id no.3所示)；
19、下游引物r:cccaagcttgggtgaggagacggtgacctgggt(seq id no.4所示)。
20、本发明的有益效果是：本发明提供了抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白纳米抗体kr-6，所述纳米抗体kr-6是通过噬菌体展示纳米抗体文库的构建和筛选获得，为重链抗体可变区片段，具有seq id no.1所示的氨基酸序列；本发明所述纳米抗体与非洲猪瘟病毒k205r蛋白和非洲猪瘟病毒均具有较高的亲和力，能够特异性识别和结合非洲猪瘟病毒，可用于非洲猪瘟的诊断、预防或治疗；并且本发明所述的纳米抗体通过大肠杆菌表达系统表达，制备方法简单。
1.一种抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白纳米抗体kr-6，所述纳米抗体kr-6的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体kr-6的核酸。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如sqe id no.2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的核酸序列。
5.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
6.如权利要求1所述的纳米抗体kr-6或权利要求5所述的免疫偶联物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
7.一种非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1所述的纳米抗体kr-6。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的纳米抗体kr-6。
9.如权利要求1所述的纳米抗体kr-6的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
10.一种扩增编码权利要求1所述纳米抗体kr-6的核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物为：
