本发明涉及生物，尤其涉及生产菜油甾醇的重组菌株及其应用。
背景技术：
1、甾体激素类药物是广泛存在于自然界动植物体内的一类特殊的多元环萜类化合物，具有多种生理活性和用途，尤其在医学领域，是一类重要的临床药物。自然界中的甾体激素类药物种类繁多，其广泛分布于动植物体内。在植物体内如大豆植物甾醇、薯蓣皂素；高等生物中如胆固醇、胆酸、维生素d、肾上腺皮质激素、性激素；昆虫中如蜕化类固醇等；低等真核生物中，如真菌与酵母菌中主要为麦角固醇。这些甾体激素类药物具有各种生物活性与生理功能，与生命过程密切相关。植物甾醇是一种重要的固醇类化合物，具有降低血液中的胆固醇浓度、预防前列腺疾病以及类激素作用。植物甾醇也被报道与降低癌症风险、抗氧化和抗骨关节炎有关。常见的植物甾醇有菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇和β－谷甾醇。其中菜油甾醇是多种药物的前体，例如:黄体酮和孕烯醇酮。此外，菜油甾醇也是下游植物类固醇的重要合成前体，如植物激素类油菜素内酯(brs)和药用上有趣的植物甾醇内酯。目前，植物甾醇主要从植物油中提取，但只能得到植物甾醇的混合物，且难以进一步分离。
2、近年来合成生物学的发展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物甾醇成为可能。相较于从植物中获得，利用微生物合成植物甾醇具有微生物生长周期短，生长繁殖不受季节、气候等条件影响的优点，有极大的前景。解脂亚罗酵母(yarrowialipolytica)是一种典型的产油真菌，经美国食药局认证为gras(generally recognizedas safe)，其遗传操作方法成熟且细胞内能积累大量的脂质。mlicˇková、holzschu等的研究表明，细胞内油脂的积累能为低极性化合物的存储提供空间，是很多疏水类化合物潜在的宿主。
3、本实验室通过用外源的7-脱氢胆固醇还原酶(dhcr7)编码基因取代内源性的c22甾醇去饱和酶(erg5)末端编码基因，已在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母中实现了油菜甾醇的生物生产。然而，该路径合成的菜油甾醇难以向下游转化生成植物类甾醇。在植物中，菜油甾醇是由麦角甾7,24(28)-二烯-3β-醇通过δ7甾醇-c5-去饱和酶(dwf7)、7-脱氢胆固醇还原酶(dwf5)和δ24(28)-甾醇还原酶(dwf1)的作用合成。2020年，yanran li等人利用植物酶在酿酒酵母中改造了菜油甾醇的生产。其通过上调甲羟戊酸途径将油菜甾醇的滴度提高到～40mg/l。2022年，lirong yang等人在酿酒酵母中引入植物δ24(28)甾醇还原酶(dwf1)构建了一条人工途径，然后进行酶定向进化，使酵母能够从头合成24-表麦角甾醇。虽然植物源dwf1等酶的混交性使其能够在酵母中产生植物甾醇，但其对前体麦角-5,7,22,24(28)-四烯-3β-醇的活性仍很低，产量水平还远未达到工业应用水平，表明需要通过蛋白质工程和代谢工程进行进一步修饰。因此，利用微生物宿主进一步探索合成植物甾醇具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了生产菜油甾醇的重组菌株及其应用。本发明首次在解脂耶氏酵母菌中实现了植物性菜油甾醇的高效合成。
2、基因组合，其包括at_dwf5基因和at_dwf1基因。
3、本发明提供的基因组合，还包括at_dwf7基因和/或erg3基因。
4、一些实施方案中，本发明所述基因组合中，所述at_dwf5基因具有：
5、1)seq id no：1所示的核苷酸序列；
6、2)在1)所示的序列中取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与a)相同或相似；
7、3)与1)或2)所示的序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；
8、所述at_dwf1基因具有：
9、4)seq id no：2所示的核苷酸序列；
10、5)在4)所示的序列中取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与a)相同或相似；
11、6)与4)或5)所示的序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；
12、所述at_dwf7基因具有：
13、7)seq id no：3所示的核苷酸序列；
14、8)在7)所示的序列中取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与a)相同或相似；
15、9)与7)或8)所示的序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
16、本发明发现了在酵母中合成植物源菜油甾醇的最佳来源的基因组合：来源于拟南芥的at_dwf5基因和at_dwf1基因，在酵母中实现了植物源菜油甾醇的生产，并具有较高的产量。在此基础上，整合at_dwf7基因后进一步增加了菜油甾醇的产量。
17、本发明中，对at_dwf5基因、at_dwf1基因和at_dwf7基因进行了密码子优化，优化后的序列依次如seq id no：1～3所示。
18、本发明提供生物材料，包括如下1)～iii)中所示的至少一种：
19、i)、含有权利要求1或2所述基因组合中至少一种基因的表达盒；
20、ii)、含有i)所述表达盒的重组载体；
21、iii)、转化或转染如ii)所述重组载体的宿主；
22、所述宿主包括mva途径强化的酵母、藻类、霉菌或细菌；
23、所述酵母包括解脂属酵母、克鲁维属酵母或酿酒酵母。
24、一些实施方案中，所述宿主含强化mva途径，且erg4基因被敲除，并表达如下1)或2)所示的基因：
25、本发明的一些实施例中，以解脂耶氏酵母为例，进行基因改造，获得重组酵母菌株。具体的，本发明还提供的重组酵母菌株，其为含强化mva途径，且erg4基因被敲除，并表达如下1)或2)所示的基因的酵母菌株：
26、1)at_dwf5、at_dwf1和at_dwf7；
27、2)at_dwf5、at_dwf1和erg3。
28、一些实施方案中，所述at_dwf7基因和/或erg3整合到酵母染色体的intd位点上。
29、本发明还提供了所述重组酵母菌株的构建方法，包括：在底盘菌中进行如下1)所示的改造，或在1)的基础上还包括如2)和/或3)所示的改造：
30、1)将at_dwf5和at_dwf1基因替换酵母内源的烟曲霉麦角固醇合成相关基因erg4。
31、2)过表达酵母内源的erg3基因；
32、3)转入拟南芥at_dwf7基因；
33、所述底盘菌为mva途径强化的解脂耶氏酵母。
34、一些实施方案中，所述拟南芥at_dwf7基因整合到酵母染色体的intd位点上。
35、一些具体实施例中，本发明以ahh12菌株为底盘菌，所述ahh12菌株的出发菌株为po1f，在po1f菌株基础上过表达e.coli源atob(erg10)、b.petrii源hmgr(erg13)和内源的hmgs。参见“engineering the oleaginous yeast yarrowia lipolytica for productionofα-farnesene.biotechnol biofuels(liu y,et al.2019dec 23；12:296)”一文中报道的ahh12菌株。
36、本发明还提供了如下任一项在制备植物源菜油甾醇中的应用：
37、本发明所述的基因组合；
38、本发明所述的生物材料；
39、本发明所述的重组酵母菌株。
40、本发明还提供了生产植物源菜油甾醇的方法，将本发明所述的重组酵母菌株，或本发明所述生物材料中的宿主，进行发酵培养。
41、一些实施方案中，以初始菌体浓度od600＝0.1将所述重组酵母菌株或所述宿主接种于发酵培养基中进行发酵培养。其中，所述发酵培养的培养基为ypd液体培养基；进一步的，所述ypd液体培养基包括水和葡萄糖50g/l、蛋白胨20g/l和酵母浸粉10g/l。所述发酵培养的条件为：28℃、220rpm条件下培养96h。
42、一些实施方案中，所述发酵培养之前还包括对所述重组酵母菌株或所述宿主进行种子培养的步骤。其中，所述种子培养的培养基为ypd液体培养基；进一步的，所述ypd液体培养基包括水和葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l和酵母浸粉10g/l。所述种子培养的条件为28℃、220rpm培养14-16h。
43、本发明以一株增强前体mva路径的解脂耶氏酵母(菌株编号为ahh12)为底盘，利用拟南芥at_dwf5、at_dwf1基因替换掉内源的erg4基因，获得了一株生产植物源菜油甾醇的重组菌株菌株sybe_yl8091001。进一步的，在该菌株染色体的intd位点整合拟南芥at_dwf7基因后，获得的菌株sybe_yl8091002进一步提高了植物性菜油甾醇的合成效率。本发明首次在解脂耶氏酵母菌中建立了植物源菜油甾醇合成路径，为后续继续搭建下游植物甾醇路径提供了优良底盘，同时为微生物人工合成植物甾醇提供了有力证据。
1.基因组合，其特征在于，包括at_dwf5基因和at_dwf1基因。
2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于，还包括at_dwf7基因和/或erg3基因。
3.根据权利要求2所述的基因组合，其特征在于，所述at_dwf5基因具有：
4.生物材料，其特征在于，包括如下1)～iii)中所示的至少一种：
5.重组酵母菌株，其特征在于，其为含强化mva途径，且erg4基因被敲除，并表达如下1)或2)所示的基因的酵母菌株：
6.根据权利要求5所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述at_dwf7基因整合在酵母染色体的intd位点上。
7.权利要求5或6所述的重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，在底盘菌中进行如下1)所示的改造，或在1)的基础上还包括如2)和/或3)所示的改造：
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述mva途径强化的解脂耶氏酵母以po1f为出发菌株，并过表达e.coli来源的erg10基因、b.petrii来源的erg13基因和内源的hmgs基因。
9.如下任一项在制备植物源菜油甾醇中的应用：
10.生产植物源菜油甾醇的方法，其特征在于，将权利要求5～6任一项所述的重组酵母菌株或权利要求4所述生物材料中的宿主，进行发酵培养。
